Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Представленный здесь дизайн эксперимента представляет собой полезную репродуктивную модель для изучения антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании в лимфатические узлы (ВН), которая исключает возмущение CD8+ Т-клеток.

Abstract

CD8+ Т-клетки опухолевого антигена из дренирующих лимфатических узлов приобретают все большее значение в формировании противоопухолевого иммунного ответа в процессе онкогенеза. Однако во многих случаях раковые клетки образуют метастатические локусы в лимфатических узлах перед дальнейшим метастазированием в отдаленные органы. В какой степени метастазы ЛН влияли на локальный и систематический ответ CD8+ Т-клеток, остается неясным. С этой целью мы создали мышиную модель метастазирования LN в сочетании с клеточной линией меланомы B16F10-GP, экспрессирующей суррогатный неоантиген, полученный из вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), гликопротеина (GP) и P14 трансгенных мышей, содержащих рецепторы Т-клеток (TCR), специфичные к пептиду GP33-41 , полученному из GP, представленному молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2Db. Этот протокол позволяет изучать антиген-специфический ответ CD8+ Т-клеток при метастазировании ВН. В рамках этого протокола мышам C57BL/6J подкожно имплантировали клетки B16F10-GP с последующим адоптивным переносом наивными клетками P14. Когда подкожная опухоль достигала примерно 5 мм в диаметре, первичную опухоль иссекали, а клетки B16F10-GP вводили непосредственно в опухоль дренирующий лимфатический узел (TdLN). Затем контролировали динамику CD8+ Т-клеток в процессе метастазирования ВН. В совокупности эта модель обеспечила подход к точному исследованию антиген-специфического иммунного ответа CD8+ Т-клеток во время метастазирования ВН.

Introduction

Иммунотерапия рака, особенно блокада контрольных точек иммунного ответа (ICB), произвела революциюв терапии рака1. ICB блокирует коингибирующие иммунорецепторы (такие как PD-1, Tim-3, LAG-3 и TIGIT), которые высоко экспрессируются в истощенных CD8+ Т-клетках в опухолевом микроокружении (TME), что приводит к оживлению истощенных CD8+ Т-клеток2. Учитывая гетерогенность истощенных CD8+ Т-клеток, накопление доказательств показало, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки, полученные с периферии, включая дренирующий лимфатический узел (dLN), но не в TME, опосредуют эффективность ICB

Protocol

Мыши C57BL/6J (относящиеся к мышам B6) и наивные трансгенные мышиP14 9,27 были в возрасте 6-10 недель с массой тела 18-22 г. Как мужчины, так и женщины были включены в исследование без рандомизации или ослепления. Все исследования на животных проводились в соответствии.......

Representative Results

Принципиальная схема этого экспериментального проекта показана на рисунке 1А. В общей сложности 5 x 105 клеток B16F10-GP в 100 мкл PBS были подкожно имплантированы в двустороннюю паховую область мышей CD45.2 C57BL/6J. Через 7 дней этим мышам с опухолью внутривенно (в/в) вводили 4 мг CT.......

Discussion

Во время онкогенеза антигенпрезентирующие клетки (APC) поглощают опухолевые антигены и мигрируют в TdLN, где они праймируют CD8+ Т-клетки. После прайминга и активации CD8+ Т-клетки покидают TdLN и проникают в опухоль, убивая опухолевые клетки10. Благодаря резекции TdLN и вве.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом выдающихся молодых ученых Китая (No 82122028 - LX), Национальным фондом естественных наук Китая (No 82173094 - LX), Фондом естественных наук Чун Цина (No 2023NSCQ-BHX0087 to SW).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubeKIRGENKG2211
100 U insulin syringeBD Biosciences 320310
15 mL conical tube BEAVER 43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma T48402-25G 
2-Methyl-2-butanolSigma240486-100ML 
70 μm nylon cell strainerBD Falcon 352350
APC anti-mouse CD45.1 BioLegend 110714Clone:A20 
B16-GP cell lineBeijing Biocytogen Co.Ltd, ChinaCustom
BSA-V (bovine serum albumin) Biossbs-0292P
cell culture dishBEAVER 43701/43702/43703 
centrifugeEppendorf5810R-A462/5424R 
cyclophosphamideSigma C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX)SigmaPHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco C11995500BT 
EDTASigmaEDS-500g 
FACS tubesBD Falcon352052
fetal bovine serum Gibco10270-106
flow cytometerBDFACSCanto II
hemocytometerPorLab ScientificHM330
isofluraneRWD life science R510-22-16 
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199 
needle carrier RWD Life Science F31034-14 
NH4Cl Sangon BiotechA501569-0500 
paraformaldehydeBeyotimeP0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2BioLegend127808Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a BioLegend100734Clone:53-6.7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
sodium azideSigmaS2002 
surgical forcepsRWD Life Science F12005-10
surgical scissorsRWD Life Science S12003-09 
suture threadRWD Life ScienceF34004-30 
trypsin-EDTASigmaT4049-100ml

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved