Модель метастазирования дренирующих лимфатических узлов для оценки динамики антиген-специфических CD8+ Т-клеток в процессе онкогенеза

Summary

Представленный здесь дизайн эксперимента представляет собой полезную репродуктивную модель для изучения антиген-специфических CD8⁺ Т-клеток при метастазировании в лимфатические узлы (ВН), которая исключает возмущение CD8⁺ Т-клеток.

Abstract

CD8⁺ Т-клетки опухолевого антигена из дренирующих лимфатических узлов приобретают все большее значение в формировании противоопухолевого иммунного ответа в процессе онкогенеза. Однако во многих случаях раковые клетки образуют метастатические локусы в лимфатических узлах перед дальнейшим метастазированием в отдаленные органы. В какой степени метастазы ЛН влияли на локальный и систематический ответ CD8⁺ Т-клеток, остается неясным. С этой целью мы создали мышиную модель метастазирования LN в сочетании с клеточной линией меланомы B16F10-GP, экспрессирующей суррогатный неоантиген, полученный из вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), гликопротеина (GP) и P14 трансгенных мышей, содержащих рецепторы Т-клеток (TCR), специфичные к пептиду GP_33-41 , полученному из GP, представленному молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I H-2D^b. Этот протокол позволяет изучать антиген-специфический ответ CD8⁺ Т-клеток при метастазировании ВН. В рамках этого протокола мышам C57BL/6J подкожно имплантировали клетки B16F10-GP с последующим адоптивным переносом наивными клетками P14. Когда подкожная опухоль достигала примерно 5 мм в диаметре, первичную опухоль иссекали, а клетки B16F10-GP вводили непосредственно в опухоль дренирующий лимфатический узел (TdLN). Затем контролировали динамику CD8⁺ Т-клеток в процессе метастазирования ВН. В совокупности эта модель обеспечила подход к точному исследованию антиген-специфического иммунного ответа CD8⁺ Т-клеток во время метастазирования ВН.

Introduction

Иммунотерапия рака, особенно блокада контрольных точек иммунного ответа (ICB), произвела революцию^{в терапии} рака1. ICB блокирует коингибирующие иммунорецепторы (такие как PD-1, Tim-3, LAG-3 и TIGIT), которые высоко экспрессируются в истощенных CD8⁺ Т-клетках в опухолевом микроокружении (TME), что приводит к оживлению истощенных CD8⁺ Т-клеток². Учитывая гетерогенность истощенных CD8⁺ Т-клеток, накопление доказательств показало, что опухолеспецифичные CD8⁺ Т-клетки, полученные с периферии, включая дренирующий лимфатический узел (dLN), но не в TME, опосредуют эффективность ICB

Protocol

Мыши C57BL/6J (относящиеся к мышам B6) и наивные трансгенные мыши^{P14 9,27} были в возрасте 6-10 недель с массой тела 18-22 г. Как мужчины, так и женщины были включены в исследование без рандомизации или ослепления. Все исследования на животных проводились в соответствии.......

Discussion

Во время онкогенеза антигенпрезентирующие клетки (APC) поглощают опухолевые антигены и мигрируют в TdLN, где они праймируют CD8⁺ Т-клетки. После прайминга и активации CD8⁺ Т-клетки покидают TdLN и проникают в опухоль, убивая опухолевые клетки¹⁰. Благодаря резекции TdLN и вве.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml