וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Summary

וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.

Abstract

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק את יכולת הנטרול של דגימות בסרום, בנוסף לשימוש הידוע יותר שלהם בריפוי גנטי להעברת גן מעניין. PVs פגומים בשכפול מכיוון שהגנום הנגיפי מחולק לפלסמידים שונים שאינם משולבים ב- PVs. מערכת בטוחה ורב-תכליתית זו מאפשרת שימוש ב-PVs במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה כללית לייצור PVs לנטי-ויראליים המבוססים על שלושה פלסמידים שהוזכרו כאן: (1) פלסמיד עמוד השדרה הנושא את גן המדווח הדרוש לניטור הזיהום; (2) פלסמיד האריזה הנושא את הגנים לכל החלבונים המבניים הדרושים לייצור PVs; (3) פלסמיד ביטוי הגליקופרוטאין של מעטפת פני השטח הקובע את הטרופיזם של הנגיף ומתווך את כניסת הנגיפים לתא המארח. בעבודה זו, SARS-CoV-2 Spike הוא הגליקופרוטאין במעטפת המשמש לייצור של SARS-CoV-2 פסאודו-וירוסים פסאודו-טייפ שאינם משוכפלים.

בקצרה, תאי אריזה (HEK293T) הודבקו יחד עם שלושת הפלסמידים השונים בשיטות סטנדרטיות. לאחר 48 שעות, הסופרנאטנט שהכיל את ה-PVs נקצר, סונן ואוחסן בטמפרטורה של -80°C. ההדבקה של SARS-CoV-2 PVs נבדקה על ידי לימוד הביטוי של הגן המדווח (luciferase) בקו תא המטרה 48 שעות לאחר ההדבקה. ככל שהערך עבור יחידות לומינסנציה יחסית (RLUs) גבוה יותר, כך שיעור הזיהום/התמרה גבוה יותר. יתר על כן, PVs זיהומיות נוספו לדגימות הסרום בדילול סדרתי כדי לחקור את תהליך הנטרול של כניסת פסאודו-וירוסים לתאי המטרה, שנמדד כירידה בעוצמת RLU: ערכים נמוכים יותר המתאימים לפעילות נטרול גבוהה.

Introduction

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים המשמשים במיקרוביולוגיה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח לפתוגן-פתוגן ^1,2,3,4. PVs מורכבים מחלק פנימי, הליבה הנגיפית, המגנה על הגנום הנגיפי, וחלק חיצוני, הגליקופרוטאינים המעטפתיים על פני השטח של הנגיף המגדירה את הטרופיזם⁵. פסאודו-וירוס אינו כשיר לשכפול בתא היעד מכיוון שהוא אינו מכיל את כל המידע הגנטי ליצירת חלקיקים נגיפיים חדשים. שילוב זה של תכונות מוזרות הופך PVs חלופה בטוחה וירוס wildtype. וירוסים מסוג Wildtype, לעומת זאת, הם פתוגניים מאוד ולא ניתן להשתמש בהם במעבדות BSL 2 לניתו....

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועוקב אחר הנחיות הוועדה האתית של אוניברסיטת ורונה (פרוטוקול אישור מספר 1538). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מהנבדקים האנושיים שהשתתפו במחקר. דגימות דם שלמות נאספו ממתנדבי עובדי בריאות (HCW) שהיו בתהליך קבלת חיסונים נגד SARS-CoV-2. דגימות אלה נאספו בצינורות פלסטיק המכילים נוג?.......

Discussion

למרות ששימוש בנגיף wildtype מדמה את הזיהום בפועל, PVs לנטי-ויראליים הם אפשרות בטוחה יותר לחקור את המנגנונים הקשורים לכניסה וזיהום ויראלי ללא דרישות הבטיחות המחמירות הדרושות לעבודה עם וירוסים פתוגניים ^4,20,21. PVs מורכבים מליבה נגיפית פגומה בשכפול.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100