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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Abstract

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a capacidade neutralizante de amostras de soro, além de seu uso mais conhecido em terapia gênica para a entrega de um gene de interesse. Os PVs são defeituosos de replicação porque o genoma viral é dividido em diferentes plasmídeos que não são incorporados aos PVs. Este sistema seguro e versátil permite o uso de PVs em laboratórios de nível 2 de biossegurança. Aqui, apresentamos uma metodologia geral para produzir PVs lentivirais baseada em três plasmídeos como mencionado aqui: (1) o plasmídeo da espinha dorsal que carrega o gene repórter necessário para monitorar a infecção; (2) o plasmídeo de embalagem que carrega os genes de todas as proteínas estruturais necessárias para gerar os PVs; (3) plasmídeo de expressão de glicoproteínas na superfície do envelope que determina o tropismo viral e medeia a entrada viral na célula hospedeira. Neste trabalho, a Spike de SARS-CoV-2 é a glicoproteína do envelope usada para a produção de lentivírus pseudotipados SARS-CoV-2 não replicativos.

Resumidamente, as células de embalagem (HEK293T) foram co-transfectadas com os três diferentes plasmídeos usando métodos padrão. Após 48 h, o sobrenadante contendo as VVPP foi colhido, filtrado e armazenado a -80 °C. A infectividade dos PVs SARS-CoV-2 foi testada estudando a expressão do gene repórter (luciferase) em uma linhagem celular alvo 48 h após a infecção. Quanto maior o valor das unidades de luminescência relativa (RLUs), maior a taxa de infecção/transdução. Além disso, os PVs infecciosos foram adicionados às amostras de soro diluídas em série para estudar o processo de neutralização da entrada de pseudovírus nas células-alvo, medido como a redução na intensidade da RLU: valores mais baixos correspondentes à alta atividade neutralizante.

Introduction

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares utilizadas em microbiologia para estudar interações vírus-hospedeiro e patógeno-patógeno 1,2,3,4. Os PVs consistem em uma parte interna, o núcleo viral que protege o genoma viral, e uma parte externa, as glicoproteínas do envelope na superfície do vírus que definem o tropismo5. Um pseudovírus é incompetente em replicação na célula-alvo porque não contém toda a informação genética para gerar novas partículas virais. Essa combinação de características peculiares torn....

Protocol

O presente protocolo foi aprovado e segue as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Verona (protocolo de aprovação número 1538). Consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos participantes do estudo. Amostras de sangue total foram coletadas de voluntários de profissionais de saúde que estavam no processo de receber vacinas anti-SARS-CoV-2. Essas amostras foram coletadas em tubos plásticos contendo anticoagulantes para posterior isolamento do soro15.

Representative Results

Este protocolo descreve a produção de PVs SARS-CoV-2 e uma aplicação a jusante destes PVs para analisar a actividade da neutralização do soro/plasma dos indivíduos que recebem a vacinação anti-COVID-1917. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para produzir pseudotipos de cada variante de preocupação SARS-CoV-2 (VOC) para testar a evolução da resposta neutralizante. Apesar desse protocolo facilitar o estudo da resposta imune humoral após a vacinação contra a COVID-19, ele po.......

Discussion

Embora o uso de um vírus selvagem simule a infecção real, os PVs lentivirais são uma opção mais segura para estudar os mecanismos associados à entrada e infecção viral sem os rígidos requisitos de segurança necessários para trabalhar com vírus patogênicos 4,20,21. Os PVs são compostos por um núcleo viral defeituoso de replicação circundado pela glicoproteína do envelope de superfície de um vírus patogênico,.......

Acknowledgements

Reconhecemos a contribuição dos profissionais de saúde voluntários. Este projeto foi apoiado pelo Departamento de Excelência 2023/2027, MUR, Itália. A AR e a DZ foram apoiadas pela PRIN2022 (fundos da UE; NextGenerationEU)

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filterSARSTEDT83 1826
6-well plateSARSTEDT83 3920
96-well plateSARSTEDT8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsMerck10403892
Black Opaque 96-well MicroplatePerkin Elmer60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium SIGMA-ALDRICHD6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)AUROGENEAU-L0615-500
Foetal Bovine SerumAUROGENEAU-S1810-500
Graphpad Prism version 7graphpad dotmaticsNAIn the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cellsATCCCRL-3216
HEK293T/ACE2 cellsATCCCRL-3216HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine AUROGENEAU-X0550-100
Luminometer - Victor3Perkin ElmerHH35000500In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmidDi Genova et al., 2021A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmidDi Genova et al., 2021A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycinAUROGENEAU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)SIGMA-ALDRICH408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)Addgene145839This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmidAddgenepGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay SystemPerkin Elmer6066759In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1xAUROGENEAU-L0949-100

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