Diagnóstico Rápido Baseado na Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) da Infecção por Helicobacter pylori e Resistência a Antibióticos

Summary

O protocolo apresenta um método não invasivo para o diagnóstico rápido de infecções estomacais pelo Helicobacter pylori através do teste de cordas e determina sua resistência antibiótica à claritromicina e levofloxacina usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).

Abstract

O Helicobacter pylori é um importante patógeno humano que infecta aproximadamente metade da população mundial e está se tornando uma séria ameaça à saúde devido à sua crescente resistência aos antibióticos. É o agente causador de gastrite crônica ativa, úlcera péptica e câncer gástrico e foi classificado como carcinógeno do Grupo I pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso do H. pylori e a determinação de sua resistência a antibióticos são importantes para a erradicação eficiente desse patógeno bacteriano. Atualmente, os métodos de diagnóstico do H. pylori incluem principalmente o teste respiratório da ureia (UBT), o teste de antígeno, o teste de anticorpos séricos, a gastroscopia, o teste rápido da urease (RUT) e a cultura bacteriana. Dentre eles, os três primeiros métodos de detecção são não invasivos, ou seja, são testes de fácil realização. No entanto, as bactérias não podem ser recuperadas através dessas técnicas; portanto, o teste de resistência a drogas não pode ser realizado. Os três últimos são exames invasivos, mas são caros, exigem alta habilidade e têm o potencial de causar danos aos pacientes. Portanto, um método não invasivo, rápido e simultâneo para detecção de H. pylori e teste de resistência a drogas é muito importante para a erradicação eficiente do H. pylori na prática clínica . Este protocolo tem como objetivo apresentar um procedimento específico envolvendo o teste de cordas em combinação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a rápida detecção da infecção por H. pylori e resistência a antibióticos. Ao contrário das culturas bacterianas, este método permite o diagnóstico fácil, rápido e não invasivo do estado de infecção por H. pylori e resistência aos medicamentos. Especificamente, usamos qPCR para detectar rea para infecção por H. pylori e mutações nos genes 23S rRNA e gyrA , que codificam resistência contra claritromicina e levofloxacina, respectivamente. Comparado às técnicas de cultivo rotineiramente utilizadas, este protocolo fornece uma técnica não invasiva, de baixo custo e economia de tempo para detectar a infecção por H. pylori e determinar sua resistência a antibióticos usando qPCR.

Introduction

H. pylori é uma bactéria gram-negativa em forma espiral, altamente móvel, que vive principalmente na região do piloro do estômago¹. É um patógeno comum que infecta cerca de 50% da população mundial². A maioria das pessoas com infecção por H. pylori não tem manifestações clínicas, e a maioria desenvolve diferentes doenças após vários anos de infecção, incluindo gastrite crônica, úlceras pépticas, úlceras gástricas e câncer gástrico³. Em vários estudos baseados em diferentes populações, a eficácia da eliminação do H. pylori na prevenção do câncer de estômago e lesões pré-c....

Protocol

O presente estudo foi conduzido de acordo com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY-Q-2022-384-02). Foram incluídos pacientes na faixa etária de 18 a 60 anos. Pacientes em uso de antibióticos, medicamentos antibacterianos chineses, medicamentos como inibidores da bomba de prótons (IBP) ou antagonistas do receptor H 2, etc., dentro de₂ semanas antes do teste nã.......

Discussion

A detecção do H. pylori pode ser realizada por métodos invasivos e não invasivos¹³. Técnicas invasivas comumente utilizadas, como histopatologia, teste rápido da urease, reação em cadeia da polimerase (PCR) e cultura bacteriana, requerem endoscopia e biópsia. Dentre os procedimentos não invasivos, recomendam-se testes sorológicos, testes respiratórios de ureia e ensaios imunoenzimáticos (ELISA)¹⁴. Enquanto os métodos não invasivos são fáceis de exe.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent