Modellazione precoce della nicchia neurovascolare dell'organoide umano non guidato nella membrana corioallantoica dell'embrione permissivo del pulcino

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.

Abstract

L'innesto di organoidi in tessuti vascolarizzati in animali modello, come la membrana corioallantoica (CAM) immunodeficiente di topo o di embrione di pulcino, si è dimostrata efficace per la modellizzazione della neovascolarizzazione. La CAM è una membrana extraembrionale riccamente vascolarizzata, che mostra una limitata immunoreattività, diventando così un eccellente modello di hosting per trapianti di cellule di origine umana.

Questo articolo descrive la strategia per innestare organoidi cerebrali umani differenziati a più stadi di maturazione nella CAM. La composizione cellulare degli organoidi cerebrali cambia nel tempo, riflettendo le pietre miliari dello sviluppo del cervello umano. Abbiamo innestato organoidi cerebrali nelle fasi di maturazione rilevanti: espansione neuroepiteliale (18 DIV), neurogenesi precoce (60 DIV) e gliogenesi precoce (180 DIV) nella CAM di embrioni di pollo del giorno embrionale (E)7. Gli organoidi cerebrali trapiantati sono stati raccolti 5 giorni dopo e le loro caratteristiche istologiche sono state analizzate.

Non sono stati rilevati segni istologici di neovascolarizzazione negli organoidi innestati o vasi sanguigni anomali adiacenti agli innesti. Inoltre, sono stati osservati notevoli cambiamenti nella composizione cellulare degli organoidi innestati, vale a dire, un aumento del numero di astrociti gliali fibrillari acidi positivi-reattivi. Tuttavia, i cambiamenti citoarchitettonici dipendevano dallo stadio di maturazione dell'organoide. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali possono crescere nella CAM e mostrano differenze nella citoarchitettura a seconda del loro stadio di maturazione all'innesto.

Introduction

Gli organoidi cerebrali umani sono una tecnica emergente che ci permette di ricapitolare lo sviluppo precoce del cervello umano in vitro ^1,2,3. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo modello è la mancanza di vascolarizzazione, che svolge ruoli indispensabili non solo nell'omeostasi cerebrale ma anche nello sviluppo cerebrale⁴. Oltre alla fornitura di ossigeno e sostanze nutritive, l'accumulo di prove suggerisce che il sistema vascolare del cervello regola la differenziazione neurale, la migrazione e la sinaptogenesi durante lo sviluppo<....

Protocol

Gli embrioni di pollo bianco livornese (Gallus gallus) sono stati trattati seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, e gli esperimenti sono stati approvati dal Council for Care and Use of Experiment Animals dell'Università di Barcellona.

1. Preparazione di organoidi cerebrali non guidati

1. Mantenere le cellule staminali embrion.......

Discussion

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato con numerosi passaggi chiave che forniscono una crescita e uno sviluppo favorevoli degli organoidi cerebrali umani dopo l'innesto senza perturbare la sopravvivenza degli embrioni di pollo. Si consiglia l'uso di aghi sterili per perforare la camera d'aria dell'uovo dopo 24 ore di incubazione (giorno 1). Inoltre, abbiamo anche provato a fare la puntura al giorno 4 (dopo aver controllato attraverso il guscio d'uovo con la luce per testare lo sviluppo della vascolarizza.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse	BioLegend	801201	1:1,000
Anti-GFAP, rabbit	GeneTex	GTX108711	1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat.	Invitrogen	A-21206	1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat	Jackson ImmunoResearch	715-585-150	1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs	Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI	Invitrogen	D1306	1:10,000
DPX	Sigma	100579	xylene-based mounting medium
Gentle Dissociation Solution	CreativeBiolabs	ITS-0622-YT187	cell dissociation solution
Matrigel	BD Biosciences	356234
Mowiol 4-88 mounting media	Merk	81381
Paper towel, lab-grade	Sigma-Aldrich	Z188956
ROCK inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors	VWR	470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ