Este estudo fornece dados experimentais para o tratamento da nefropatia por imunoglobulina A (IgAN) com Dioscina (DIO), o ingrediente ativo do Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), e um paradigma para estudar os efeitos da fitoterapia e os mecanismos subjacentes in vivo e in vitro.
O aumento da IgA1 circulante deficiente em galactose (Gd-IgA1) é causado pela ativação excessiva de células secretoras positivas para IgA no processo de respostas imunes da mucosa, que é um elo crítico na patogênese da nefropatia por IgA (IgAN). A mancha de Peyer, o local proeminente onde os linfócitos B são transformados em células plasmáticas secretoras de IgA, é a principal fonte de IgA. Além disso, a menor expressão do núcleo 1β-1,3-galactosiltransferase (C1GalT1) e sua chaperona molecular, chaperona molecular específica de C1GalT1 (Cosmc), está relacionada à glicosilação anormal de IgA1 em pacientes com NIgA. Nossa experiência clínica mostra que o fitoterápico de Dioscoreae Nipponicae Rhitoma (DNR) pode aliviar a proteinúria e a hematúria e melhorar a função renal em pacientes com NIgA. A dioscina (DIO) é um dos principais ingredientes ativos do DNR, que possui diversas atividades farmacológicas. Este estudo explora o possível mecanismo de DIO no tratamento de IgAN. O camundongo modelo de IgAN foi estabelecido por indução imune da mucosa. Os camundongos foram divididos nos grupos controle, modelo e gavagem DIO. A deposição de IgA glomerular em camundongos, alterações patológicas renais e a expressão dos marcadores de células B CD20 e CXCR5 no adesivo de Peyer foram detectadas por imunofluorescência e imuno-histoquímica. Após a estimulação do lipopolissacarídeo (LPS), os efeitos do DIO na proliferação de células DAKIKI, secreção de IgA e Gd-IgA1, expressão de C1GalT1 e Cosmc foram estudados pelo ensaio do kit de contagem de células-8 (CCK-8), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (QRT-PCR) e western blotting (WB). Em estudos in vivo , a deposição de IgA acompanhada de hiperplasia mesangial glomerular e aumento da expressão de CD20 e CXCR5 no adesivo de Peyer no camundongo modelo de NIgA foi aliviada por DIO.Estudos in vitro mostraram que 0,25 μg/mL a 1,0 μg/mL DIO inibiu a proliferação de células DAKIKI induzida por LPS, a secreção de IgA e Gd-IgA1 e regulou positivamente o mRNA e a expressão proteica de C1GalT1 e Cosmc. Este estudo demonstra que o DIO pode reduzir a produção de Gd-IgA1 inibindo a ativação excessiva de células secretoras de IgA e regulando positivamente a expressão de C1GALT1/Cosmc.
A nefropatia por IgA (NIgA) é o tipo mais comum de glomerulonefrite primária, para a qual não há tratamento específico, e continua sendo uma causa significativa de doença renal terminal1. Embora a patogênese da NIgA ainda não seja totalmente compreendida, a "hipótese multi-hit" é geralmente aceita e apoiada por um grande corpo de evidências de pesquisas clínicas e experimentais2. A patogênese da NIgA envolve a ativação de células B e a produção de IgA1 (Gd-IgA1)3 deficiente em Galactose. O aumento da Gd-IgA1 circulante devido à proliferação e ativação excessiva de células secretoras de IgA durante a resposta imune da mucosa é um elo crítico na patogênese da NIgA 4,5,6. Como local central para a proliferação e ativação da conversão do fenótipo de linfócitos B em células secretoras de IgA, o adesivo de Peyer é a principal fonte de secreção de IgA, intimamente relacionada à ocorrência e desenvolvimento de NIgA 7,8. Além disso, a proliferação de células secretoras de IgA1, bem como a expressão de Core 1β-1,3-galactosiltransferase (C1GalT1) e chaperona molecular específica de C1GalT1 (Cosmc), foram associadas à glicosilação anormal de IgA1, que causa a produção de GD-IgA1 em pacientes com NIgA 6,9.
O estudo clínico sobre o tratamento com NIgA com fitoterapia progrediu nos últimos anos. Yiqi Qingjie Formula é uma fórmula essencial para o tratamento de NIgA pelo Departamento de Nefrologia do Hospital Guang'anmen. O estudo anterior do nosso grupo descobriu que o Gd-IgA1 diminuiu no soro de pacientes com NIgA após o tratamento com Yiqi Qingjie Formula. Como uma das ervas mais utilizadas na Fórmula Yiqi Qingjie, Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) é o rizoma seco de Dioscorea Nipponica Makino, que tem várias funções como regular a imunidade, suprimir a inflamação, aliviar a tosse e a asma10,11. Vários estudiosos trataram NIgA com DNR e obtiveram bons resultados 12,13,14. Como principal ingrediente ativo do DNR15, a dioscina (DIO) reduz o ácido úrico, inibe a fibrose, inibe a resposta inflamatória e o estresse antioxidante 16,17. Portanto, o DIO pode ter um novo mecanismo de ação para inibir a secreção celular de Gd-IgA1 excessivo e exercer efeitos específicos de proteção renal. Ainda assim, nenhum estudo foi relatado sobre o mecanismo de ação da DIO para o tratamento da NIgA.
Para explorar o potencial mecanismo terapêutico do DIO na NIgA e fornecer um novo método para o tratamento da NIgA, realizamos experimentos para os efeitos terapêuticos do DIO na NIgA in vivo e in vitro.
O comitê de ética do Hospital de Guanganmen aprovou este experimento (número de aprovação ética do experimento com animais: IACUC-GAMH-2023-003).
1. Preparando camundongos para o procedimento experimental
2. Análise histológica
3. Análise imuno-histoquímica do adesivo de Peyer
4. Imunofluorescência renal de IgA
5. Cultura de células
6. Ensaios de citotoxicidade de LDH para triagem de concentrações seguras de DIO em células DAKIKI normais
7. Ensaio CCK-8 para detectar o efeito de DIO na proliferação celular DAKIKI
8. ELISA para detectar o efeito de DIO na secreção de IgA e Gd-IgA1 por células DAKIKI
9. qRT-PCR para detectar o efeito de DIO nos níveis de mRNA de C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI
10. Western blotting para examinar o efeito do DIO na expressão das proteínas C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI
11. Agosto Análise estatística
Efeito da DIO no tecido renal em modelo de camundongos IgNIa
Em comparação com o grupo controle, o modelo de camundongos IgNI induzido pelo sistema imunológico da mucosa (grupo modelo) teve um aumento significativo na proteinúria (Figura 2 suplementar), a deposição de IgA foi visível na região mesangial, a fluorescência foi uniformemente distribuída em aglomerados por toda a região mesangial (Figura 1A), a coloração PAS do tecido renal mostrou proliferação de células mesangiais e hiperplasia estromal (Figura 1B), que foi reduzida no grupo gavagem DIO (grupo DIO).
Efeito da DIO sobre linfócitos B em adesivo de Peyer
O adesivo de Peyer é o principal local de conversão de linfócitos B em células secretoras de IgA. Tomamos o adesivo de Peyer como objeto de pesquisa para observar o efeito da DIO sobre os linfócitos B, detectando a expressão dos marcadores de células B CD20 e CXCR5. Os resultados imuno-histoquímicos mostraram que a expressão de CD20 e CXCR5 foi significativamente maior no grupo modelo em comparação com o grupo controle. DIO pode inibir a expressão dos marcadores moleculares acima (Figura 2A, B).
A faixa de concentração segura de DIO em células DAKIKI
O LDH é um marcador da integridade da membrana plasmática e um indicador de morte celular, com taxas de liberação de LDH mais altas indicando danos celulares mais graves. O ensaio de liberação de LDH foi usado para determinar a faixa de concentração segura de DIO. A concentração máxima segura de DIO foi determinada por uma taxa de liberação de LDH abaixo de 10%. Os resultados (Figura 3) não mostraram citotoxicidade significativa induzida por DIO nas concentrações de 0,25 a 1,0 μg/mL. Portanto, o estudo a seguir usou 0,25, 0,5 e 1,0 μg / mL DIO como nível de dosagem.
Efeitos do DIO na proliferação de células DAKIKI
Os resultados experimentais (Figura 4) mostraram que, em comparação com o grupo modelo (grupo estimulado por LPS), o DIO inibiu a proliferação de células DAKIKI induzida por LPS de maneira dependente da concentração. DIO nas concentrações de 0,5 e 1,0 μg/mL inibiu significativamente a proliferação de células DAKIKI induzida por LPS (P < 0,01).
Efeitos do DIO na função secretora das células DAKIKI
Os níveis de Gd-IgA1 estão intimamente relacionados ao processo patológico da NIgA, e a IgA total é testada em conjunto como um indicador da função secretora celular. Um ensaio ELISA foi usado para detectar o conteúdo de IgA e Gd-IgA1 no sobrenadante da cultura de células DAKIKI. Os resultados mostraram (Figura 5A,B) que as células DAKIKI estimuladas por LPS secretaram mais IgA em comparação com o grupo controle (P < 0,01). Em comparação, o DIO inibiu significativamente as células DAKIKI de secretar IgA (P < 0,01) de maneira dependente da concentração. Em comparação com o grupo controle, as células DAKIKI estimuladas por LPS secretaram mais Gd-IgA1 com tendência estatística (P < 0,10), e DIO inibiu a secreção de Gd-IgA1 de células DAKIKI estimuladas por LPS de maneira dependente da concentração (P < 0,05 e P < 0,01), entre as quais DIO a 1,0 μg/mL inibiu significativamente a secreção de Gd-IgA1 com a taxa inibida de 25%.
O mecanismo de DIO inibe a secreção de Gd-IgA1 pelas células DAKIKI
Para investigar ainda mais o possível mecanismo de DIO inibindo a secreção excessiva de Gd-IgA1 pelas células DAKIKI, os níveis de C1GALT1 glicosilada transferase e mRNA da proteína chaperona Cosmc em células DAKIKI foram detectados por qRT-PCR, e os resultados mostraram (Figura 6A, B) que a expressão relativa de mRNA de C1GALT1 e Cosmc foi regulada negativamente em células DAKIKI no grupo modelo em comparação com o grupo controle (P < 0,01). DIO regulou positivamente a expressão relativa de mRNA de C1GALT1 e Cosmc em diferentes graus em comparação com o grupo modelo, com DIO 1,0 μg / mL regulou significativamente a expressão relativa de mRNA de C1GALT1 e Cosmc (P < 0,05).
Ao mesmo tempo, o método WB foi usado para detectar o efeito de DIO na expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI. Em comparação com o grupo controle, a expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI no grupo modelo diminuiu obviamente (P < 0,05). Em comparação com o grupo modelo, a expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc após a intervenção DIO foi regulada positivamente. A expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc foi significativamente regulada positivamente por DIO na concentração de 1,0 μg / mL (P < 0,05) ( Figura 7A-C ).
Figura 1: Histopatologia dos rins. (A) Microscópio de imunofluorescência. Cortes renais de camundongos em cada grupo foram corados com anti-IgA (verde) e DAPI (azul). A barra de escala da imagem acima = 200 μm. A barra de escala de imagem abaixo = 50 μm. n = 6 por grupo. (B) Imagens representativas da coloração PAS de tecido renal de camundongos nos grupos Controle, Modelo e DIO. Barra de escala = 30 μm. A seta para baixo mostra as células mesangiais e a seta para cima mostra o estroma. Barra de escala = 30 μm. n = 6 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do DIO nos marcadores de linfócitos B. (A) A expressão de CD20 no adesivo de Peyer. Barra de escala = 200 μm. n = 6 por grupo. (B) A expressão de CXCR5 no adesivo de Peyer. As barras de escala estão no canto inferior direito da imagem. Barra de escala = 200 μm. n = 6 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Triagem da concentração segura de DIO em células DAKIKI. Os valores estatísticos são expressos como a média ± DP de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Diferentes concentrações de DIO afetam a proliferação de células DAKIKI. Os dados foram expressos em média ±DP. Em comparação com o grupo controle, **P < 0,01; em comparação com o grupo modelo, #P < 0,05' ##P < 0,01; Os resultados de todos os experimentos foram repetidos três vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. DIO inibe a secreção de IgA e Gd-IgA1 pelas células DAKIKI. (A) O método ELISA detectou a expressão de IgA em cada grupo. (B) O método ELISA detectou a expressão de Gd-IgA1 em cada grupo. Os dados foram expressos como média ± DP. Em comparação com o grupo controle, **P < 0,01; em comparação com o grupo modelo, #P < 0,05, ##P < 0,01; Todos os resultados experimentais foram repetidos três vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. O mecanismo de DIO inibe a secreção excessiva de Gd-IgA1 pelas células DAKIKI. (A) QRT-PCR detectou a expressão de mRNA de C1GALT1. (B) QRT-PCR detectou a expressão de mRNA de Cosmc. Os dados foram expressos como média ± DP. Em comparação com o grupo controle, **P<0,01; em comparação com o grupo modelo, #P < 0,05, ##P < 0,01; Todos os resultados experimentais foram repetidos três vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. DIO afeta a expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc em células DAKIKI. (A) WB verificou a regulação positiva da expressão proteica de C1GALT1 e Cosmc por DIO. (B) A análise semiquantitativa da expressão de C1GALT1 foi realizada usando a imagem J. (C) Análise semiquantitativa da expressão de Cosmc usando a imagem J. Os dados foram expressos como média ±DP. Em comparação com o grupo controle, *P < 0,05; em comparação com o grupo modelo, #P < 0,05, ##P < 0,01, todos os resultados experimentais foram repetidos três vezes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1. O esquema para o modelo in vivo. Clique aqui para baixar esta figura.
Figura suplementar 2. Alterações na proteinúria. Os dados foram expressos como média ± DP; n = 6 por grupo. Clique aqui para baixar esta figura.
A característica patológica da NIgA é a deposição de imunocomplexos contendo IgA1 e GD-IgA1 na região mesangial do glomérulo21,22. Reduzir a formação de complexos imunes pode reduzir a lesão renal e aliviar os sintomas clínicos da NIgA. Em um experimento in vivo, estudamos os efeitos terapêuticos do DIO no NIgA e descobrimos que o DIO pode reduzir a deposição de IgA no rim de camundongos modelo de NIgA Está demonstrado que o acúmulo de células secretoras de IgA no rim está relacionado à patogênese da NIgA23. Como um importante local de proliferação e ativação de linfócitos B, o adesivo de Peyer é uma importante fonte de células secretoras de IgA, então examinamos a expressão de marcadores de linfócitos B (CD20, CXCR5) no adesivo de Peyer e descobrimos que o DIO poderia inibir a expressão de linfócitos B no modelo de camundongos IgAN do adesivo de Peyer. Esses resultados experimentais podem fornecer uma base para a aplicação de DIO no tratamento de NIgA.
Realizamos os seguintes experimentos in vitro para investigar melhor o mecanismo de ação do DIO sobre o NIgA. Em primeiro lugar, foi demonstrado anteriormente que DAKIKI, uma linhagem de células B imortalizada por EBV que secreta IgA1, parte da qual é GD-IgA124, é ideal para pesquisa in vitro do mecanismo de ação da droga sobre IgAN. Escolhemos células DAKIKI para investigar o mecanismo molecular de DIO no tratamento de NIgA. Além disso, a resposta imune inflamatória da mucosa desempenha um papel fundamental na patogênese do NIgA. Como mencionado acima, usamos LPS para estimular as células DAKIKI, que podem liberar fatores pró-inflamatórios e mediar respostas inflamatórias, o que pode imitar melhor o mecanismo das respostas imunes da mucosa no NIgA. O modelo celular in vitro pode ajudar a investigar a possibilidade e o mecanismo de outras drogas para o tratamento da NIgA. Os resultados mostraram que o DIO inibiu a proliferação de células DAKIKI estimuladas pelo LPS de maneira dependente da concentração. O DIO pode inibir a secreção de IgA e Gd-IgA1 em células DAKIKI causada pela estimulação de LPS e regular positivamente a expressão de mRNA e proteína de C1GalT1 e sua chaperona Cosmc em células DAKIKI, sugerindo que DIO poderia reduzir a secreção de Gd-IgA1 regulando positivamente a expressão de C1GALT1 / Cosmc e, assim, inibir a ativação excessiva de células DAKIKI.
As principais etapas devem ser observadas durante os procedimentos experimentais. A concentração de Gd-IgA1 no sobrenadante da célula DAKIKI não está dentro da faixa de detecção do kit ELISA (1,56 ~ 100 ng / mL), e o sobrenadante coletado deve ser centrifugado por um tubo de ultrafiltração para obter o Gd-IgA1 concentrado. Além disso, certifique-se de que o volume de sobrenadante a partir de cada grupo seja o mesmo e o volume final de concentrado obtido após a ultrafiltração seja o mesmo.
Neste estudo, usamos métodos in vitro e in vivo simultaneamente, que podem se apoiar mutuamente nos efeitos farmacológicos e fornecer um exemplo para estudar os efeitos e seus mecanismos da fitoterapia. Algumas coisas poderiam ser melhoradas neste protocolo. Em primeiro lugar, não detectamos concentrações sanguíneas no grupo de gavagem DIO dos camundongos; portanto, a concentração de DIO equivalente às concentrações sanguíneas não é usada em experimentos in vitro . Em segundo lugar, apenas o monômero DIO, o componente ativo do DNR, foi investigado; os efeitos de outros componentes da DNR na NIgA ainda precisam de mais estudos.
Em conclusão, este estudo fornece uma base experimental para o tratamento de NIgA com DIO, o ingrediente ativo da DNR. Este estudo estabeleceu um modelo patológico celular de NIgA mimetizando a resposta imune da mucosa de NIgA tanto in vitro quanto in vivo. Dá uma nova ideia para estudar a medicina tradicional chinesa para prevenir e tratar a NIgA.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973675).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-CD20/MS4A1 Antibody | Boster Biotechnology Company | A03780-3 | |
Antifade mounting medium | Beyotime, Shanghai, China | P0128S | |
Balb/c mice | Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 110322220101424000 | |
blocking serum | Solarbio, Beijing, China | SL038 | |
Bovine gamma globulin | ShangHai YuanYe Biotechnology Company | S12031 | |
C1GALT1 polyclonal antibody | Proteintech Group, Inc,USA | 27569-1-AP | |
Citrate antigen retrieval solution(50×) | Phygene Biotechnology Company | PH0422 | |
COSMC polyclonal antibody | Proteintech Group, Inc,USA | 19254-1-AP | |
Cytotoxiciy detection kit | Roche Company | 4744926001 | |
Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+ | Dako | K5007 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Dioscin | National Institute For Food and Drug Control | 111707-201703 | |
DIO tablets | Chengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd. | H51023866 | |
ECL working solution | Merck Biotechnology, Inc | WBKLS0100 | |
Enhanced cell counting kit-8 | Beyotime, Shanghai, China | C0043 | |
Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premix | TIANGEN,Beijing, China | KR118-02 | |
Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit | BaSO Biotechnology Company | BA4080A | |
Goat anti-mouse IgA-AF488 | SouthernBiotech | 1040-30 | |
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugated | BeiJing Bioss Biotechnology Company | BS-0295G-HRP | |
Human Gd-IgA1 ELISA kit | IBL | 27600 | |
Human IgA ELISA kit | MultiSciences (LiankeBio) | 70-EK174-96 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23227 | |
PMSF solution | Beyotime, Shanghai, China | ST507 | |
Proteinase K | Phygene Biotechnology Company | PH1521 | |
Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody | BeiJing Bioss Biotechnology Company | bs-23570R | |
RIPA lysis buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | |
RNAsimple total RNA extraction kit | TIANGEN,Beijing, China | DP419 | |
RPMI Medium 1640 | Solarbio, Beijing, China | 31800 | |
Super-Bradford protein assay kit | CWBIO, Beijing, China | CW0013 | |
Triton X-100 | Beyotime, Shanghai, China | ST795 | |
β-Actin Rabbit mAb | Abclonal, Wuhan, China | AC026 |
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