在基因工程小鼠模型中识别、诊断和分级恶性周围神经鞘瘤

Summary

我们开发了一种方法来评估基因工程小鼠的神经系统肿瘤是否准确地概括了人类对应物的病理学。在这里，我们将这些组织学技术、定义的病理学标准和培养方法应用于 P 0-GGFβ3 小鼠模型中出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤。

Abstract

常染色体显性遗传肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 患者通常会发展为丛状神经纤维瘤 （PN），随后转化为高度侵袭性恶性周围神经鞘瘤 （MPNST）。基因工程小鼠 （GEM） 模型的可用性将有助于了解 PN 转化为 MPNST 的过程，这些模型可以准确复制在 NF1 患者中看到的 PN-MPNST 进展。不幸的是，具有 Nf1 消融的 GEM 模型并不能完全概括这一过程。这导致我们开发了 P 0-GGFβ3 小鼠，这是一种 GEM 模型，其中雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 （NRG1） 在雪旺细胞中的过表达导致 PN 的发展，这些 PN 会发展为高频的 MPNST。然而，为了确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生和肿瘤进展是否准确地模拟了 NF1 患者所观察到的过程，我们必须首先证明 P_0-GGFβ3 周围神经鞘瘤的病理学概括了其人类对应物的病理学。

在这里，我们描述了使用 P 0-GGFβ3 和 P_0-GGFβ3 在 GEM 模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专用方法;以Trp53^+/-小鼠为例。我们描述了用于诊断 PN 和 MPNST 的组织学、免疫组化和组织化学方法，如何将这些肿瘤与模仿其病理学的其他肿瘤类型区分开来，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们讨论了从 GEM MPNST 建立早期传代培养物，如何使用免疫细胞化学表征这些培养物，以及如何通过建立同种异体移植物来验证它们的致瘤性。总的来说，这些技术表征了GEM模型中出现的PN和MPNST的病理学，并将这些小鼠肿瘤的病理学与人类肿瘤进行了批判性比较。

Introduction

在过去的三十年中，许多实验室试图通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组或过表达在人类癌症中过度表达的基因产物来创建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠 （GEM） 模型可用于多种目的，例如确定新引入的基因组修饰启动肿瘤发生，识别导致肿瘤进展的其他随后发生的遗传或表观遗传变化，以及定义驱动肿瘤启动和进展的关键信号通路。与依赖于使用免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有功能齐全的免疫系统，因此可以更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，当将 GEM 癌症模型用于此类目的时，研究人员必须确认对 GEM 肿瘤的观察与人类对应物相关。该验证应包括对 GEM 肿瘤病理学的彻底评估，并确定 GEM 肿瘤的病理特征是否概括了相应人类肿瘤类型的病理学。

肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 是影响人类神经系统的最常见的遗传疾病，每 3,000-3,500 名活产婴儿中约有 1 名发生 ^1,2,3。患有 NF1 的个体在其皮肤（真皮神经纤维瘤）以及大神经和神经丛（丛状神经纤维瘤）中出现多个良性周围神经鞘瘤，称为神经纤维瘤。虽然真皮神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤都会通过产生身体、行为和/或社会障碍而恶化患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤 （PN） 尤其危险

Protocol

此处描述的程序已获得南卡罗来纳医科大学 IACUC 的批准，并由经过适当培训的人员根据 NIH 实验动物护理和使用指南和 MUSC 的机构动物护理指南执行。

1. 确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤外显率和存活率，并鉴定这些动物的肿瘤以进一步表征

1. 生成将评估肿瘤发生的小鼠队列。所需的小鼠数量取决于肿瘤表型的外显率。为了弥补这些损失，请从比所需的最终动物数量高 10-15% 的队列开始。
   注意：我们在 50 只小鼠的初始队列中凭经验确定了 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤外显率（其中 6 只因与肿瘤无关的原因（例如，战斗）而丢失）²⁵。
2. 每周评估动物的健康状况三次，并记录每次检查的身体状况评分，包括体重和行为变化。使用二氧化碳安乐死和宫颈脱位终止荷瘤或垂死的小鼠（见下文注释）。以天为单位记录死亡年龄。如果肿瘤在外部可见，请记录肿瘤尺寸（长度、宽度和高度）。
   注意：至关重要的是，不允许动物超过IACUC批准的最大允许肿瘤大小和/或人道终点。
3. 使用死亡年龄，建立 Kaplan-Meier 生存曲线以确定平均死亡年龄和生存范围。
   注：P 0-GGFβ3小鼠的平均死亡年龄为261.5天，范围为74-533天;我们队列中 91% 患有多发性神经纤维瘤，71% 患有 ....

Discussion

这里介绍的组织学和生化方法为诊断和表征神经纤维瘤的GEM模型和MPNST发病机制提供了一个框架。多年来，我们发现这些方法对于评估 GEM 模型^21、25、26 中出现的周围神经鞘瘤的病理学非常有用。然而，虽然这里概述的方案对于确定GEM模型中的肿瘤如何准确地概括其人类对应物的病理学很有用，但这些策略存在一些局限性，应?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31