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  • Summary
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  • Introduction
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Summary

我们开发了一种方法来评估基因工程小鼠的神经系统肿瘤是否准确地概括了人类对应物的病理学。在这里，我们将这些组织学技术、定义的病理学标准和培养方法应用于 P 0-GGFβ3 小鼠模型中出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤。

Abstract

常染色体显性遗传肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 患者通常会发展为丛状神经纤维瘤 （PN），随后转化为高度侵袭性恶性周围神经鞘瘤 （MPNST）。基因工程小鼠 （GEM） 模型的可用性将有助于了解 PN 转化为 MPNST 的过程，这些模型可以准确复制在 NF1 患者中看到的 PN-MPNST 进展。不幸的是，具有 Nf1 消融的 GEM 模型并不能完全概括这一过程。这导致我们开发了 P 0-GGFβ3 小鼠，这是一种 GEM 模型，其中雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 （NRG1） 在雪旺细胞中的过表达导致 PN 的发展，这些 PN 会发展为高频的 MPNST。然而，为了确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生和肿瘤进展是否准确地模拟了 NF1 患者所观察到的过程，我们必须首先证明 P0-GGFβ3 周围神经鞘瘤的病理学概括了其人类对应物的病理学。

在这里，我们描述了使用 P 0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3 在 GEM 模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专用方法;以Trp53+/-小鼠为例。我们描述了用于诊断 PN 和 MPNST 的组织学、免疫组化和组织化学方法，如何将这些肿瘤与模仿其病理学的其他肿瘤类型区分开来，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们讨论了从 GEM MPNST 建立早期传代培养物，如何使用免疫细胞化学表征这些培养物，以及如何通过建立同种异体移植物来验证它们的致瘤性。总的来说，这些技术表征了GEM模型中出现的PN和MPNST的病理学，并将这些小鼠肿瘤的病理学与人类肿瘤进行了批判性比较。

Introduction

在过去的三十年中，许多实验室试图通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组或过表达在人类癌症中过度表达的基因产物来创建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠 （GEM） 模型可用于多种目的，例如确定新引入的基因组修饰启动肿瘤发生，识别导致肿瘤进展的其他随后发生的遗传或表观遗传变化，以及定义驱动肿瘤启动和进展的关键信号通路。与依赖于使用免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有功能齐全的免疫系统，因此可以更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，当将 GEM 癌症模型用于此类目的时，研究人员必须确认对 GEM 肿瘤的观察与人类对应物相关。该验证应包括对 GEM 肿瘤病理学的彻底评估，并确定 GEM 肿瘤的病理特征是否概括了相应人类肿瘤类型的病理学。

肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 是影响人类神经系统的最常见的遗传疾病，每 3,000-3,500 名活产婴儿中约有 1 名发生 1,2,3。患有 NF1 的个体在其皮肤（真皮神经纤维瘤）以及大神经和神经丛（丛状神经纤维瘤）中出现多个良性周围神经鞘瘤，称为神经纤维瘤。虽然真皮神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤都会通过产生身体、行为和/或社会障碍而恶化患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤 （PN） 尤其危险

Protocol

此处描述的程序已获得南卡罗来纳医科大学 IACUC 的批准，并由经过适当培训的人员根据 NIH 实验动物护理和使用指南和 MUSC 的机构动物护理指南执行。

1. 确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤外显率和存活率，并鉴定这些动物的肿瘤以进一步表征

  1. 生成将评估肿瘤发生的小鼠队列。所需的小鼠数量取决于肿瘤表型的外显率。为了弥补这些损失，请从比所需的最?.......

Representative Results

图 2 显示了 P 0-GGFβ3 小鼠中出现的明显肿瘤的例子。肉眼容易识别的肿瘤可以看作是肿块扩张的身体区域，如图2A（箭头）所示。在确定肿瘤是否可能是周围神经鞘瘤时，必须确定肿瘤与周围神经有关。在这种情况下，MRI扫描（图2B）表明肿瘤与坐骨神经（箭头）有关;在对小鼠实施安乐死并解剖肿瘤后证实了这种关联。应.......

Discussion

这里介绍的组织学和生化方法为诊断和表征神经纤维瘤的GEM模型和MPNST发病机制提供了一个框架。多年来，我们发现这些方法对于评估 GEM 模型21、25、26 中出现的周围神经鞘瘤的病理学非常有用。然而，虽然这里概述的方案对于确定GEM模型中的肿瘤如何准确地概括其人类对应物的病理学很有用，但这些策略存在一些局限性，应?.......

Acknowledgements

这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（R01 NS048353和R01 NS109655）的资助。R01 NS109655-03S1 至 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 至 S.L.C.）和国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 至 S.L.C.）。

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

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