Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

Summary

O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Abstract

O uso de hidrogéis derivados da matriz extracelular (MEC) na engenharia de tecidos tem se tornado cada vez mais popular, pois podem mimetizar o ambiente natural das células in vitro. No entanto, manter o conteúdo bioquímico nativo da MEC, alcançar estabilidade mecânica e compreender o impacto do processo de decelularização nas propriedades mecânicas dos hidrogéis da MEC são um desafio. Neste trabalho, foi descrito um pipeline para a descelularização do tecido pulmonar bovino utilizando dois protocolos diferentes, caracterização a jusante da eficácia da descelularização, fabricação de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada reconstituídos e avaliação de suas propriedades mecânicas e citocompatibilidade. A descelularização do pulmão bovino foi realizada por método físico (ciclos de congelamento-descongelamento) ou químico (à base de detergente). A coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para validar a decelularização e retenção dos principais componentes da MEC. Para a avaliação do conteúdo residual de colágeno e glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) nas amostras decelularizadas, foram empregadas as técnicas de coloração Sirius red e Alcian blue, respectivamente. As propriedades mecânicas dos hidrogéis de MEC pulmonar decelularizado foram caracterizadas por reologia oscilatória. Os resultados sugerem que hidrogéis de pulmão bovino decelularizados podem fornecer uma alternativa organotípica confiável aos produtos comerciais de MEC por reter a maioria dos componentes nativos da MEC. Além disso, esses achados revelam que o método de descelularização de escolha afeta significativamente a cinética de gelificação, bem como a rigidez e as propriedades viscoelásticas dos hidrogéis resultantes.

Introduction

As condições convencionais de cultivo de monocamadas não oferecem uma representação fiel dos microambientes de tecidos nativos e carecem da capacidade de fornecer um arcabouço tridimensional (3D) com ligantes instrutivos que possibilitem interações célula-matriz e célula-célula¹. A composição da matriz extracelular (MEC) e as propriedades mecânicas são altamente tecido-específicas, tempo-dependentes e sofrem alterações em condições patológicas. Portanto, há necessidade de modelos teciduais 3D biomiméticos que permitam a sintonia de tais características, a modulação do comportamento celular e o alcance da funcionalidade tecidual desejada. Biomat....

Protocol

Pulmões nativos frescos de doadores bovinos jovens (1-2 anos de idade) foram obtidos de um abatedouro local e transportados em um recipiente plástico selado sobre gelo para o laboratório. O sacrifício dos animais é realizado para consumo geral de carne (pulmões descartados como resíduos) e não tem relação ou é devido ao estudo. Confirmamos que o matadouro cumpre as leis e regulamentos nacionais de sacrifício de animais. Além disso, confirmamos que utilizamos apenas resíduos e que o projeto de pesquisa não .......

Discussion

Os hidrogéis derivados de órgãos tornaram-se modelos promissores que recapitulam a MEC tecidual nativa e mimetizam a função celular organotípica. Embora a MEC pulmonar decelularizada tenha sido frequentemente usada em engenharia de tecidos, uma caracterização completa da composição do biomaterial e das propriedades mecânicas beneficiará uma melhor compreensão de como as interações célula-MEC podem ser moduladas para modelar processos biológicos durante a homeostase ou doença. Particularmente, a avaliaç.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298