יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Summary

ניתן לטהר הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מיון תאים, באמצעות שילוב של צביעת מולקולת הידבקות תאי לויקוציטים מיטוכונדריאלית ופעילה (ALCAM, הידועה גם בשם CD166).

Abstract

לתאי גזע עובריים אנושיים (ES) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יש יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית מבוססת תאים לטיפול באיברים חולים קשה בשל ההתרבות הבלתי מוגבלת שלהם ותכונותיהם הפלוריפוטנטיות. עם זאת, התמיינות תאי ES/iPS אנושיים לסוגי תאי מטרה טהורים ב-100% היא מאתגרת בשל רגישותם הגבוהה לסביבה. גידולים לאחר ההשתלה נגרמים על ידי תאים מזוהמים, מתרבים ובלתי ממוינים, מה שהופך את טכנולוגיית הטיהור הגבוהה לחיונית למימוש בטוח של רפואה רגנרטיבית. כדי להפחית את הסיכון לגידולים, פותחה טכנולוגיית טיהור גבוהה עבור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. השיטה משתמשת ב-FACS (מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) באמצעות שילוב של תכולת מיטוכונדריה גבוהה וסמן פני התא ALCAM (מולקולת היצמדות תאי לויקוציטים פעילים) ללא שינוי גנטי. 97% ± 0.38% (n = 5) מהפטוציטים המטוהרים בשיטה זו הציגו ביטוי חלבון אלבומין. מאמר זה נועד לספק נהלים מפורטים עבור שיטה זו, כפי שהיא מיושמת בשיטת ההתמיינות הדו-ממדית העדכנית ביותר עבור תאי iPS אנושיים להפטוציטים.

Introduction

תאי גזע עובריים ופלוריפוטנטיים מושרים (ES ו- iPS, בהתאמה) נחשבים למקורות תאים מבטיחים לטיפולים רגנרטיביים. עם זאת, היעילות של התמיינות תאים אלה לסוגי תאי יעד ספציפיים יכולה להשתנות, גם כאשר משתמשים באותו קו תאים, פרוטוקול ונסיין 1,2,3,4. ניתן לייחס שונות זו לרגישות הגבוהה של תאי ES/iPS אנושיים לסביבתם. לכן, כיום קשה להשיג באופן עקבי תאי מטרה טהורים. כדי להשיג רפואה רגנרטיבית בטוחה ביותר, חיוני לחסל תאים מתרבים ותאי גזע לא ממוינים בתאים טיפוליים, וטכנולוגיית טיהור מתקדמת לתאי מטרה חיונית ^5,6,7

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בתאי iPS אנושיים שהושגו באופן מסחרי (זן 253G1) (ראו טבלת חומרים).

1. תחזוקה של תאי iPS אנושיים

1. שמור על תאי iPS אנושיים בתנאים נטולי הזנה בתווך AK02 על צלחות תרבית מצופות 0.25 מיקרוגרם/ס"מ² iMatrix-511 (ראה טבלת חומרים).

<.......

Discussion

בשל תפקודם במטבוליזם של חומרי מזון וניקוי רעלים, לפטוציטים יש מספר גדול יחסית של מיטוכונדריה בהשוואה לסוגי תאים אחרים¹⁵. ALCAM הוא חבר במשפחת האימונוגלובולינים וממלא תפקיד בהידבקות תאים ובנדידה. הוא מתבטא בסוגי תאים שונים, כולל כבד, אפיתל, לימפוציטים, מיאלואידים, פיברובלסטים ות?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159