Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ניתן לטהר הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מיון תאים, באמצעות שילוב של צביעת מולקולת הידבקות תאי לויקוציטים מיטוכונדריאלית ופעילה (ALCAM, הידועה גם בשם CD166).

Abstract

לתאי גזע עובריים אנושיים (ES) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יש יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית מבוססת תאים לטיפול באיברים חולים קשה בשל ההתרבות הבלתי מוגבלת שלהם ותכונותיהם הפלוריפוטנטיות. עם זאת, התמיינות תאי ES/iPS אנושיים לסוגי תאי מטרה טהורים ב-100% היא מאתגרת בשל רגישותם הגבוהה לסביבה. גידולים לאחר ההשתלה נגרמים על ידי תאים מזוהמים, מתרבים ובלתי ממוינים, מה שהופך את טכנולוגיית הטיהור הגבוהה לחיונית למימוש בטוח של רפואה רגנרטיבית. כדי להפחית את הסיכון לגידולים, פותחה טכנולוגיית טיהור גבוהה עבור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. השיטה משתמשת ב-FACS (מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) באמצעות שילוב של תכולת מיטוכונדריה גבוהה וסמן פני התא ALCAM (מולקולת היצמדות תאי לויקוציטים פעילים) ללא שינוי גנטי. 97% ± 0.38% (n = 5) מהפטוציטים המטוהרים בשיטה זו הציגו ביטוי חלבון אלבומין. מאמר זה נועד לספק נהלים מפורטים עבור שיטה זו, כפי שהיא מיושמת בשיטת ההתמיינות הדו-ממדית העדכנית ביותר עבור תאי iPS אנושיים להפטוציטים.

Introduction

תאי גזע עובריים ופלוריפוטנטיים מושרים (ES ו- iPS, בהתאמה) נחשבים למקורות תאים מבטיחים לטיפולים רגנרטיביים. עם זאת, היעילות של התמיינות תאים אלה לסוגי תאי יעד ספציפיים יכולה להשתנות, גם כאשר משתמשים באותו קו תאים, פרוטוקול ונסיין 1,2,3,4. ניתן לייחס שונות זו לרגישות הגבוהה של תאי ES/iPS אנושיים לסביבתם. לכן, כיום קשה להשיג באופן עקבי תאי מטרה טהורים. כדי להשיג רפואה רגנרטיבית בטוחה ביותר, חיוני לחסל תאים מתרבים ותאי גזע לא ממוינים בתאים טיפוליים, וטכנולוגיית טיהור מתקדמת לתאי מטרה חיונית 5,6,7

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בתאי iPS אנושיים שהושגו באופן מסחרי (זן 253G1) (ראו טבלת חומרים).

1. תחזוקה של תאי iPS אנושיים

  1. שמור על תאי iPS אנושיים בתנאים נטולי הזנה בתווך AK02 על צלחות תרבית מצופות 0.25 מיקרוגרם/ס"מ2 iMatrix-511 (ראה טבלת חומרים).

<.......

Representative Results

ציר הזמן של התהליכים שגורמים לתאי iPS אנושיים להתמיין להפטוציטים באמצעות תרבית דו-ממדית (איור 1A) ותכונות תאים מייצגות (איור 1B) מוצגים. בערך ביום ההתמיינות ה-12 החלו התאים להציג צורות תאים מצולעים וגרעינים עגולים, האופייניים להפטוציטים. חלק מהפטוציטים הציגו גם.......

Discussion

בשל תפקודם במטבוליזם של חומרי מזון וניקוי רעלים, לפטוציטים יש מספר גדול יחסית של מיטוכונדריה בהשוואה לסוגי תאים אחרים15. ALCAM הוא חבר במשפחת האימונוגלובולינים וממלא תפקיד בהידבקות תאים ובנדידה. הוא מתבטא בסוגי תאים שונים, כולל כבד, אפיתל, לימפוציטים, מיאלואידים, פיברובלסטים ות?.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה מספר מענק [23390072].

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
253G1 human iPS cell lineRIKEN BioResource Research CenterHPS0002
4% paraformaldehydeFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-20145
Activin A Solution, Human, RecombinantNACALAI TESQUE, INC.18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1ChemiconMAB1281Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSAria IIIBD BiosciencesCell sorter
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182 
Ciclosporin AFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation035-18961
CollagenaseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-24023ROCK inhibitor
DexamethasoneFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning352235
Fetal Bovine SerumBiowest51820-500
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 AntibodyR&D SystemsAF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigma-AldrichH2270
iMatrix-511 silkNippi892021
ImmunoBlockKACCTKN001Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation090-06741
Leibovitz's L-15 MediumFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)Toronto Research ChemicalsH293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human AlbuminDakoA0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)NACALAI TESQUE, INC.28353-85
RPMI-1640FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation189-02025
Sodium L-AscorbateNACALAI TESQUE, INC.03422-32
StemFit AK02NREPROCELLRCAK02N
TBS (10x)NACALAI TESQUE, INC.12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)Thermo Fisher ScientificT668
Triton X-100NACALAI TESQUE, INC.28229-25
Trypan Blue SolutionNACALAI TESQUE, INC.20577-34
TRYPSIN 250Difco215240
Tryptose phosphate broth solutionSigma-AldrichT8159

References

  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241 (2018).
  2. Laco, F., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

FACSALCAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved