A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
ניתן לטהר הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מיון תאים, באמצעות שילוב של צביעת מולקולת הידבקות תאי לויקוציטים מיטוכונדריאלית ופעילה (ALCAM, הידועה גם בשם CD166).
לתאי גזע עובריים אנושיים (ES) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יש יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית מבוססת תאים לטיפול באיברים חולים קשה בשל ההתרבות הבלתי מוגבלת שלהם ותכונותיהם הפלוריפוטנטיות. עם זאת, התמיינות תאי ES/iPS אנושיים לסוגי תאי מטרה טהורים ב-100% היא מאתגרת בשל רגישותם הגבוהה לסביבה. גידולים לאחר ההשתלה נגרמים על ידי תאים מזוהמים, מתרבים ובלתי ממוינים, מה שהופך את טכנולוגיית הטיהור הגבוהה לחיונית למימוש בטוח של רפואה רגנרטיבית. כדי להפחית את הסיכון לגידולים, פותחה טכנולוגיית טיהור גבוהה עבור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. השיטה משתמשת ב-FACS (מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) באמצעות שילוב של תכולת מיטוכונדריה גבוהה וסמן פני התא ALCAM (מולקולת היצמדות תאי לויקוציטים פעילים) ללא שינוי גנטי. 97% ± 0.38% (n = 5) מהפטוציטים המטוהרים בשיטה זו הציגו ביטוי חלבון אלבומין. מאמר זה נועד לספק נהלים מפורטים עבור שיטה זו, כפי שהיא מיושמת בשיטת ההתמיינות הדו-ממדית העדכנית ביותר עבור תאי iPS אנושיים להפטוציטים.
תאי גזע עובריים ופלוריפוטנטיים מושרים (ES ו- iPS, בהתאמה) נחשבים למקורות תאים מבטיחים לטיפולים רגנרטיביים. עם זאת, היעילות של התמיינות תאים אלה לסוגי תאי יעד ספציפיים יכולה להשתנות, גם כאשר משתמשים באותו קו תאים, פרוטוקול ונסיין 1,2,3,4. ניתן לייחס שונות זו לרגישות הגבוהה של תאי ES/iPS אנושיים לסביבתם. לכן, כיום קשה להשיג באופן עקבי תאי מטרה טהורים. כדי להשיג רפואה רגנרטיבית בטוחה ביותר, חיוני לחסל תאים מתרבים ותאי גזע לא ממוינים בתאים טיפוליים, וטכנולוגיית טיהור מתקדמת לתאי מטרה חיונית 5,6,7
במחקר זה נעשה שימוש בתאי iPS אנושיים שהושגו באופן מסחרי (זן 253G1) (ראו טבלת חומרים).
1. תחזוקה של תאי iPS אנושיים
<.......
ציר הזמן של התהליכים שגורמים לתאי iPS אנושיים להתמיין להפטוציטים באמצעות תרבית דו-ממדית (איור 1A) ותכונות תאים מייצגות (איור 1B) מוצגים. בערך ביום ההתמיינות ה-12 החלו התאים להציג צורות תאים מצולעים וגרעינים עגולים, האופייניים להפטוציטים. חלק מהפטוציטים הציגו גם.......
בשל תפקודם במטבוליזם של חומרי מזון וניקוי רעלים, לפטוציטים יש מספר גדול יחסית של מיטוכונדריה בהשוואה לסוגי תאים אחרים15. ALCAM הוא חבר במשפחת האימונוגלובולינים וממלא תפקיד בהידבקות תאים ובנדידה. הוא מתבטא בסוגי תאים שונים, כולל כבד, אפיתל, לימפוציטים, מיאלואידים, פיברובלסטים ות?.......
עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה מספר מענק [23390072].
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
253G1 human iPS cell line | RIKEN BioResource Research Center | HPS0002 | |
4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
Activin A Solution, Human, Recombinant | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | Antibody against human nuclear antigen |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BD FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
Ciclosporin A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
Collagenase | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Gel-like basement membrane matrix |
CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | ROCK inhibitor |
Dexamethasone | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | 51820-500 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine |
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody | R&D Systems | AF1172 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H2270 | |
iMatrix-511 silk | Nippi | 892021 | |
ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | Blocking solution |
ITS-G Supplement(×100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin | Dako | A0001 | |
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
Sodium L-Ascorbate | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
Trypan Blue Solution | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
Tryptose phosphate broth solution | Sigma-Aldrich | T8159 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved