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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Abstract

As células-tronco embrionárias humanas (ES) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa baseada em células para o tratamento de órgãos gravemente doentes devido à sua proliferação ilimitada e propriedades pluripotentes. No entanto, diferenciar as células ES/iPS humanas em tipos de células-alvo 100% puras é um desafio devido à sua alta sensibilidade ao meio ambiente. A tumorigênese após o transplante é causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, tornando a tecnologia de alta purificação essencial para a realização segura da medicina regenerativa. Para mitigar o risco de tumorigênese, uma tecnologia de alta purificação foi desenvolvida para hepatócitos derivados de células iPS humanas. O método emprega FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) usando uma combinação de alto conteúdo mitocondrial e o marcador de superfície celular ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas) sem modificação genética. 97% ± 0,38% (n = 5) dos hepatócitos purificados usando este método exibiram expressão da proteína albumina. Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos detalhados para este método, aplicado ao método de diferenciação bidimensional mais atual para células iPS humanas em hepatócitos.

Introduction

Células-tronco embrionárias e pluripotentes induzidas (ES e iPS, respectivamente) são consideradas fontes celulares promissoras para terapias regenerativas. No entanto, a eficiência de diferenciar essas células em tipos específicos de células-alvo pode variar, mesmo quando se usa a mesma linhagem celular, protocolo e experimentador 1,2,3,4. Essa variabilidade pode ser atribuída à alta sensibilidade das células ES / iPS humanas ao seu ambiente. Portanto, atualmente é difícil obter consistentemente células-alvo puras. Para alcançar uma medici....

Protocol

Este estudo utilizou células iPS humanas obtidas comercialmente (cepa 253G1) (ver Tabela de Materiais).

1. Manutenção de células iPS humanas

  1. Manter as células iPS humanas em condições livres de alimentador em meio AK02 em placas de cultura revestidas com 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (ver Tabela de Materiais).

2. Diferenciação hepática de células iPS humanas em culturas 2D

Representative Results

A linha do tempo dos processos que induzem as células iPS humanas a se diferenciarem em hepatócitos por meio de cultura 2D (Figura 1A) e características celulares representativas (Figura 1B) são mostradas. Aproximadamente no dia 12 de diferenciação, as células começaram a exibir formas celulares poligonais e núcleos redondos, característicos dos hepatócitos. Alguns hepatócitos também exibiram multinucleação.

A análise .......

Discussion

Devido às suas funções no metabolismo de nutrientes e na desintoxicação, os hepatócitos possuem um número relativamente grande de mitocôndrias em comparação com outros tipos de células15. O ALCAM é um membro da superfamília das imunoglobulinas e desempenha um papel na adesão e migração celular. É expressa em vários tipos celulares, incluindo células hepáticas, epiteliais, linfocíticas, mieloides, fibroblastas e neuronais16. Ao utilizar uma combinação .......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia número de concessão [23390072].

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
253G1 human iPS cell lineRIKEN BioResource Research CenterHPS0002
4% paraformaldehydeFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-20145
Activin A Solution, Human, RecombinantNACALAI TESQUE, INC.18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1ChemiconMAB1281Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSAria IIIBD BiosciencesCell sorter
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182 
Ciclosporin AFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation035-18961
CollagenaseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning354230Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-24023ROCK inhibitor
DexamethasoneFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning352235
Fetal Bovine SerumBiowest51820-500
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 AntibodyR&D SystemsAF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigma-AldrichH2270
iMatrix-511 silkNippi892021
ImmunoBlockKACCTKN001Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation090-06741
Leibovitz's L-15 MediumFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)Toronto Research ChemicalsH293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human AlbuminDakoA0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)NACALAI TESQUE, INC.28353-85
RPMI-1640FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation189-02025
Sodium L-AscorbateNACALAI TESQUE, INC.03422-32
StemFit AK02NREPROCELLRCAK02N
TBS (10x)NACALAI TESQUE, INC.12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)Thermo Fisher ScientificT668
Triton X-100NACALAI TESQUE, INC.28229-25
Trypan Blue SolutionNACALAI TESQUE, INC.20577-34
TRYPSIN 250Difco215240
Tryptose phosphate broth solutionSigma-AldrichT8159

References

  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241 (2018).
  2. Laco, F., et al.

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