Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Summary

Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Abstract

As células-tronco embrionárias humanas (ES) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa baseada em células para o tratamento de órgãos gravemente doentes devido à sua proliferação ilimitada e propriedades pluripotentes. No entanto, diferenciar as células ES/iPS humanas em tipos de células-alvo 100% puras é um desafio devido à sua alta sensibilidade ao meio ambiente. A tumorigênese após o transplante é causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, tornando a tecnologia de alta purificação essencial para a realização segura da medicina regenerativa. Para mitigar o risco de tumorigênese, uma tecnologia de alta purificação foi desenvolvida para hepatócitos derivados de células iPS humanas. O método emprega FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) usando uma combinação de alto conteúdo mitocondrial e o marcador de superfície celular ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas) sem modificação genética. 97% ± 0,38% (n = 5) dos hepatócitos purificados usando este método exibiram expressão da proteína albumina. Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos detalhados para este método, aplicado ao método de diferenciação bidimensional mais atual para células iPS humanas em hepatócitos.

Introduction

Células-tronco embrionárias e pluripotentes induzidas (ES e iPS, respectivamente) são consideradas fontes celulares promissoras para terapias regenerativas. No entanto, a eficiência de diferenciar essas células em tipos específicos de células-alvo pode variar, mesmo quando se usa a mesma linhagem celular, protocolo e experimentador 1,2,3,4. Essa variabilidade pode ser atribuída à alta sensibilidade das células ES / iPS humanas ao seu ambiente. Portanto, atualmente é difícil obter consistentemente células-alvo puras. Para alcançar uma medici....

Protocol

Este estudo utilizou células iPS humanas obtidas comercialmente (cepa 253G1) (ver Tabela de Materiais).

1. Manutenção de células iPS humanas

1. Manter as células iPS humanas em condições livres de alimentador em meio AK02 em placas de cultura revestidas com 0,25 μg/cm² iMatrix-511 (ver Tabela de Materiais).

2. Diferenciação hepática de células iPS humanas em culturas 2D

Discussion

Devido às suas funções no metabolismo de nutrientes e na desintoxicação, os hepatócitos possuem um número relativamente grande de mitocôndrias em comparação com outros tipos de células¹⁵. O ALCAM é um membro da superfamília das imunoglobulinas e desempenha um papel na adesão e migração celular. É expressa em vários tipos celulares, incluindo células hepáticas, epiteliais, linfocíticas, mieloides, fibroblastas e neuronais¹⁶. Ao utilizar uma combinação .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159