יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי

Summary

מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.

Abstract

האתגרים הקיימים כיום בתיקון גידים ורצועות מחייבים איתור מועמד מתאים ויעיל לטיפול תאי לקידום התחדשות הגידים. תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) נחקרו כאסטרטגיה פוטנציאלית להנדסת רקמות לתיקון גידים. בעוד שהם רב-פוטנטיים ויש להם פוטנציאל התחדשות in vivo, הם מוגבלים ביכולת ההתחדשות העצמית שלהם ומפגינים הטרוגניות פנוטיפית. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים לעקוף מגבלות אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית הגבוהה שלהם והפלסטיות ההתפתחותית שאין דומה לה. בהתפתחות טנוציטים, סקלרקסיס (Scx) הוא וסת מולקולרי ישיר חיוני של התמיינות גידים. בנוסף, הוכח כי מכנורגולציה היא מרכיב מרכזי המנחה את התפתחות וריפוי הגידים העובריים. לכן, פיתחנו פרוטוקול לתמצת את ההשפעה הסינרגטית של גירוי ביולוגי ומכני שעשוי להיות חיוני ליצירת טנוציטים. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו לתאי סטרומה מזנכימליים (iMSCs) ואופיינו בסמנים קלאסיים של תאי סטרומה מזנכימליים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, באמצעות וקטור לנטי-ויראלי, ה-iMSCs הומרו ל-SCX בעל ביטוי יתר יציב (iMSC^SCX+). תאי iMSC^SCX+ אלה יכולים להבשיל עוד יותר ל-iTenocytes באמצעות העמסת מתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי. התאים שהתקבלו אופיינו על ידי התבוננות upregulation של סמנים גידים מוקדמים ומאוחרים, כמו גם שקיעת קולגן. שיטה זו של יצירת iTenocytes יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים בפיתוח מקור תאים אלוגני בלתי מוגבל מהמדף עבור יישומי טיפול בתאי גידים.

Introduction

כדי להתמודד עם הבעיות העכשוויות בתיקון גידים ורצועות, יש דרישה למועמד מתאים מתאים לטיפולים מבוססי תאים. אפיק מחקר אחד בהנדסת רקמות לתיקון גידים כרוך בחקר תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם במח עצם (BM-MSCs) ותאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן (ASC) כאסטרטגיות אפשריות. תאים אלה הם בעלי יכולת רב-עוצמה, שפע רב ופוטנציאל התחדשות in vivo. בנוסף, הם הראו יכולת ריפוי משופרת ותוצאות תפקודיות משופרות במודלים של בעלי חיים¹. עם זאת, תאים אלה מפגינים יכולות התחדשות עצמית מוגבלות, מגוון פנוטיפי, ובעיקר, יכולת מוגבלת ליצירת גידים. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מציעה פתרון לאילוצים אלה בשל יכולת ההתחדשות העצמית יוצאת הדופן שלה ויכולת ההסתגלות הה....

Protocol

פרוטוקול זה לייצור iTenocytes יכול להתבצע בשלושה שלבים עיקריים: iPSCs ל- iMSCs (10 ימים), iMSC ל- iMSC^SCX+ (שבועיים), iMSC^SCX+ ל- iTenocytes (מינימום 4 ימים). ניתן להשהות כל שלב משמעותי בפרוטוקול ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר, בהתאם לציר הזמן של הניסוי. עבור שיטות הכרוכות בגידול תאים, יש להשתמש בטכניקות סטרילי?.......

Discussion

בפרוטוקול זה, iTenocytes נוצרים באמצעות שלושה שלבים עיקריים: (1) אינדוקציה של iPSCs ל- iMSCs, (2) ביטוי יתר של SCX באמצעות וקטור לנטיויראלי, ו- (3) הבשלה של תאים באמצעות מתח חד צירי דו-ממדי.

הפרוטוקול שהוצג להבחנה בין iPSCs ל- iMSCs תואר בעבר על ידי קבוצה² שלנו. מאז פרסום זה, פותחו פרוטו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823