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Questo articolo descrive una procedura per produrre iTenociti generando cellule stromali mesenchimali derivate da iPSC con sovraespressione combinata di Scleraxis utilizzando un vettore lentivirale e stretching uniassiale tramite un bioreattore 2D.
Le sfide odierne nella riparazione dei tendini e dei legamenti richiedono l'identificazione di un candidato adatto ed efficace per la terapia cellulare per promuovere la rigenerazione del tendine. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono state esplorate come potenziale strategia di ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini. Sebbene siano multipotenti e abbiano un potenziale rigenerativo in vivo, sono limitati nella loro capacità di auto-rinnovamento e mostrano eterogeneità fenotipica. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aggirare queste limitazioni grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento e alla plasticità di sviluppo senza pari. Nello sviluppo dei tenociti, la sclerassi (Scx) è un regolatore molecolare diretto cruciale della differenziazione tendinea. Inoltre, è stato dimostrato che la meccanoregolazione è un elemento centrale che guida lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale. Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo per incapsulare l'effetto sinergico della stimolazione biologica e meccanica che può essere essenziale per la generazione di tenociti. Le iPSC sono state indotte a diventare cellule stromali mesenchimali (iMSC) e sono state caratterizzate con i classici marcatori delle cellule stromali mesenchimali tramite citometria a flusso. Successivamente, utilizzando un vettore lentivirale, le iMSC sono state trasdotte per sovraesprimere stabilmente SCX (iMSCSCX+). Queste cellule iMSCSCX+ possono essere ulteriormente maturate in iTenociti tramite carico di trazione uniassiale utilizzando un bioreattore 2D. Le cellule risultanti sono state caratterizzate dall'osservazione della sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché della deposizione di collagene. Questo metodo di generazione di iTenociti può essere utilizzato per aiutare i ricercatori a sviluppare una fonte di cellule allogeniche potenzialmente illimitata per applicazioni di terapia cellulare tendinea.
Per affrontare i problemi contemporanei nella riparazione di tendini e legamenti, è necessario disporre di una cellula candidata pertinente adatta alle terapie cellulari. Una via di indagine nell'ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini coinvolge l'esplorazione delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) e delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ASC) come potenziali strategie. Queste cellule hanno capacità multipotenti, grande abbondanza e potenziale rigenerativo in vivo. Inoltre, hanno mostrato una maggiore capacità di guarigione e migliori risultati funzionali nei modelli animali1. ....
Questo protocollo per la produzione di iTenociti può essere condotto in tre fasi principali: da iPSC a iMSC (10 giorni), da iMSC a iMSCSCX+ (2 settimane), da iMSCSCX+ a iTenociti (minimo 4 giorni). Ogni fase principale del protocollo può essere messa in pausa e riavviata in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale. Per i metodi coinvolti nella coltura delle cellule, devono essere impiegate tecniche sterili. Tutte le cellule di questo protocollo devono essere coltivate a 37 °C, .......
Differenziazione delle iPSC umane in iMSCs
Come descritto in precedenza, l'attuale protocollo per differenziare le iPSC in iMSC prevede la formazione di corpi embrioidi2. Questo processo richiede circa dieci giorni per indurre le iMSC dalle iPSC (Figura 1A). Tuttavia, si consiglia vivamente di passare gli iMSC appena generati almeno due volte. Questo non solo aiuta a eliminare la necessità di piastre rivestite di gelatina, ma stabilisce anche un'e.......
In questo protocollo, gli itenociti sono generati attraverso tre fasi principali: (1) induzione di iPSC a iMSC, (2) sovraespressione di SCX utilizzando un vettore lentivirale e (3) maturazione delle cellule attraverso la tensione uniassiale 2D.
Il protocollo presentato per differenziare le iPSC in iMSC è stato precedentemente descritto dal nostro gruppo2. Da quella pubblicazione, sono stati sviluppati numerosi protocolli, tra cui un protocollo consolidato per l'utilizz.......
Questo studio è stato parzialmente supportato dal NIH/NIAMS K01AR071512 e dal CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. I due plasmidi di confezionamento dei lentivirus sono stati donati dal laboratorio Simon Knott (Dipartimento di Scienze Biomediche, Cedars-Sinai Medical Center).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |
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