Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

Summary

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Abstract

Os desafios atuais no reparo de tendões e ligamentos requerem a identificação de um candidato adequado e eficaz para a terapia baseada em células para promover a regeneração tendínea. Células estromais mesenquimais (CTMs) têm sido exploradas como uma potencial estratégia de engenharia tecidual para reparo tendíneo. Embora sejam multipotentes e tenham potencial regenerativo in vivo, são limitados em sua capacidade de autorrenovação e exibem heterogeneidade fenotípica. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem contornar essas limitações devido à sua alta capacidade de autorrenovação e plasticidade de desenvolvimento incomparável. No desenvolvimento de tenócitos, a Scleraxis (Scx) é um regulador molecular direto crucial da diferenciação tendínea. Além disso, a mecanoregulação tem se mostrado um elemento central que orienta o desenvolvimento e a cicatrização do tendão embrionário. Como tal, desenvolvemos um protocolo para encapsular o efeito sinérgico da estimulação biológica e mecânica que pode ser essencial para a geração de tenócitos. As iPSCs foram induzidas a se tornarem células estromais mesenquimais (iMSCs) e foram caracterizadas com marcadores clássicos de células estromais mesenquimais via citometria de fluxo. Em seguida, usando um vetor lentiviral, as iMSCs foram transduzidas para SCX superexpressas estavelmente (iMSC^SCX+). Essas células^{iMSC SCX+} podem ser posteriormente amadurecidas em iTenócitos via carga de tração uniaxial usando um biorreator 2D. As células resultantes foram caracterizadas observando-se a suprarregulação dos marcadores tendinosos precoce e tardio, bem como a deposição de colágeno. Este método de geração de iTenócitos pode ser usado para auxiliar os pesquisadores no desenvolvimento de uma fonte alogênica alogênica potencialmente ilimitada para aplicações de terapia celular de tendão.

Introduction

Para resolver as questões contemporâneas no reparo de tendões e ligamentos, há um requisito para um candidato celular pertinente adequado para terapias baseadas em células. Uma via de investigação em engenharia tecidual para reparo tendíneo envolve a exploração de células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (CTMs-MO) e células estromais derivadas do tecido adiposo (CTAs) como estratégias potenciais. Essas células têm capacidade multipotente, grande abundância e potencial regenerativo in vivo. Além disso, demonstraram maior capacidade de cicatrização e melhora dos resultados funcionais em modelos animais¹. No entanto, essas....

Protocol

Este protocolo de produção de iTenócitos pode ser realizado em três etapas principais: iPSCs para iMSCs (10 dias), iMSC para iMSC^SCX+ (2 semanas), iMSC^SCX+ para iTenócitos (mínimo 4 dias). Cada etapa principal do protocolo pode ser pausada e reiniciada posteriormente, dependendo do cronograma experimental. Para os métodos envolvidos com a cultura de células, técnicas estéreis devem ser empregadas. Todas as células deste protocolo devem ser cultivadas a 37 °C, 5% CO₂ e 95% de u.......

Discussion

Neste protocolo, os iTenócitos são gerados através de três etapas principais: (1) indução de iPSCs para iMSCs, (2) superexpressão de SCX usando um vetor lentiviral e (3) maturação das células através de tensão uniaxial 2D.

O protocolo apresentado para diferenciar iPSCs em iMSCs foi previamente descrito por nosso grupo². Desde essa publicação, vários protocolos foram desenvolvidos, incluindo um protocolo estabelecido para o uso de iMSCs em ensaios clínico.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823