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Biochemistry

단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리

Published: October 27th, 2023

DOI:

10.3791/65844

1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.

생체액의 세포외 소포체(EV)는 최근 액체 생검 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 거의 모든 유형의 세포에서 방출되는 이 세포는 숙주 세포의 실시간 스냅샷을 제공하며 단백질, 특히 세포 기능과 질병 발병 및 진행의 주요 역할을 하는 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 있는 단백질을 포함한 풍부한 분자 정보를 포함합니다. 그러나 현재 EV 분리 방법의 낮은 수율과 불순물로 인해 생체 유체에서 EV를 분리하는 것은 여전히 어렵기 때문에 EV 인단백질과 같은 EV 화물의 다운스트림 분석이 어렵습니다. 여기에서는 인간의 소변 및 다운스트림 단백질체학 및 EV 분리 후 인산염체 분석과 같은 생체 유체로부터 EV를 분리하기 위한 기능성 자성 비드를 기반으로 하는 빠르고 효과적인 EV 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV의 높은 회수율과 EV 단백질체 및 포스포프로테옴의 민감한 프로파일을 가능하게 했습니다. 또한 이 프로토콜의 다양성과 관련 기술 고려 사항도 여기에서 다룹니다.

세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막에 캡슐화된 나노 입자이며 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 유체에 존재합니다.1,2,3,4. EV는 숙주 세포의 생리학적 및 병리학적 상태를 반영하는 다양한 생체 활성 분자의 화물을 운반하므로 질병 진행에 중요한 요인으로 기능합니다 4,5,6. 또한, 광범위한 연구를 통해 증상이 시작되거나 종양이 생리적으로 감지되기 전에 EV 기반 질병 마커를 식별할 수 있다는 것이 입증되었습니다 5,6,7.

인산화는 세포 신호 전달 및 조절의 핵심 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 인단백질은 비정상적인 인산화 사건이 조절되지 않는 세포 신호 전....

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모든 소변 샘플은 정보에 입각한 동의 후 건강한 개인으로부터 수집되었습니다. 실험은 인체 샘플과 관련된 모든 윤리 기준을 준수했으며 퍼듀 대학교 인간 연구 보호 프로그램의 지침을 준수했습니다.

1. 시료 채취

  1. 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 12mL의 소변 샘플을 원심분리하여 2,500 x g, 4°C에서 10분 동안 세포 파편과 큰 세포사멸체를 제거합니다.

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이 프로토콜은 EV 분리부터 다운스트림 단백질체학 및 인산염체 분석에 이르는 포괄적인 워크플로우를 보여줍니다(그림 1). 세 개의 소변 샘플은 EV 분리를 거쳤습니다. 분리된 EV는 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 특성화되었으며 이후 단백질 추출, 효소 분해 및 펩타이드 클린업을 포함한 질량 분석 기반 단백질체학 시료 전처리를 위해 처리되었습니다. 인산화체학 분석을 .......

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효과적인 EV 분리는 EV에서 저농도 단백질과 인단백질을 검출하기 위한 필수 전제 조건입니다. 이러한 요구를 충족시키기 위한 수많은 방법이 개발되었음에도 불구하고 대다수는 여전히 회복 불량 또는 낮은 재현성과 같은 한계로 고통받고 있으며, 이는 대규모 연구 및 일상적인 임상 환경에서 활용을 방해합니다. DUC는 일반적으로 EV 분리를 위한 가장 일반적인 방법으로 간주되며, 추가 세척 단계.......

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이 연구는 NIH 보조금 3RF1AG064250 및 R44CA239845의 일부 자금 지원을 받았습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeLife Science ProductsM-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1005
15 mL conical centrifuge tubeCorning 352097
15 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074P2
Benchtop incubated shakerBioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
ChloroacetamideSigma -AldrichC0267-100GUsed for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate Fisher Scientific E145-4Precipitates detergents
Evosep One EvosepLiquid chromatography system
EvotipsEvosepEV2013Sample loading for Evosep One system 
EVtrapTymora AnalyticalFunctionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF MembraneSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kitTymora AnalyticalPolymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate Sigma -AldrichD6750-10GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate Sigma -AldrichL9150-50GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips GlygenTT2C18.96Desalting method
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLFor EV elution. 
Triethylammonium bicabonate bufferSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifluoroacetic acidSigma -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma -AldrichC4706Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007

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EV

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