סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

סיבי שרירי השלד המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שרירי העכבר הם מודל שימושי לניסויים פיזיולוגיים. עם זאת, רוב המאמרים עוסקים בסיבים הקצרים של ה-FDB (flexor digitorum brevis), המגבילים את טווח התוצאות העוסקות בסוגי סיבים, מגבילים את כמות החומר הביולוגי הזמין ומונעים קשר ברור בין תופעות פיזיולוגיות תאיות לבין ידע ביוכימי ודינמי קודם שהושג בשרירים אחרים.

מאמר זה מתאר כיצד להשיג סיבים שלמים משישה שרירים בעלי פרופילים ואורכים שונים של סוגי סיבים. באמצעות C57BL/6 עכברים בוגרים, אנו מראים את פרוטוקול דיסקציית השרירים ובידוד הסיבים ומדגימים את התאמת הסיבים למחקרים חולפים Ca²⁺ ואפיונם המורפומטרי. הרכב סוג סיבים של השרירים מוצג גם. כאשר מנותקים, כל השרירים נותרו שלמים, סיבים חיים המתכווצים במהירות במשך יותר מ -24 שעות. FDB נתן קצר (<1 מ"מ), peroneus digiti quarti (PDQA) ו peroneus longus (PL) נתן ביניים (1-3 מ"מ), בעוד extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), ושרירי סולאוס שחררו סיבים ארוכים (3-6 מ"מ).

כאשר תועדו עם הצבע המהיר Mag-Fluo-4, Ca²⁺ transients של סיבי PDQA, PL ו-EHL הראו קינטיקה מהירה וצרה המזכירה את סוג המורפולוגיה II (MT-II), הידוע כמתאים לסיבים מסוג IIX ו-IIB. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי שרירים אלה יש מעל 90% של סיבים מסוג II לעומת FDB (~ 80%) ו soleus (~ 65%). מעבר ל-FDB, אנו מדגימים לראשונה דיסוציאציה של מספר שרירים, היוצרים סיבים המשתרעים על פני טווח אורכים שבין 1 ל-6 מ"מ. סיבים אלה הם קיימא ונותנים Ca²⁺ מהיר transients, המציין כי MT-II ניתן להכליל סיבים מהירים IIX ו- IIB, ללא קשר למקור השריר שלהם. תוצאות אלה מגדילות את הזמינות של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.

Introduction

שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת ^1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.<....

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה בניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת אנטיוקיה (UdeA) (פרוטוקול 104 מיום 21 ביוני 2016 ו-005 מיום 15 באפריל 2021), על פי חוק 84 משנת 1989 והחלטה 8430 משנת 1993 שהונפקו על ידי ממשלת קולומביה ובוצעו ודווחו בהתאם למחקר בבעלי חיים: הנחיות דיווח בניסויי Vivo (ARRIVE)

Discussion

כדי להשלים את המודלים הזמינים לחקר ביולוגיה של שרירי שלד בוגרים, כאן אנו מדגימים את הדיסוציאציה האנזימטית המוצלחת של מגוון שרירי עכבר עם סיבים קצרים, בינוניים וארוכים. סיבים אלה מאפשרים הדגמה של הכללה של קינטיקה MT-II של Ca²⁺ transients בשרירי השלד. יתר על כן, סוגי הסיבים בשרירים שלמים שלמים ס.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/