A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).
סיבי שרירי השלד המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שרירי העכבר הם מודל שימושי לניסויים פיזיולוגיים. עם זאת, רוב המאמרים עוסקים בסיבים הקצרים של ה-FDB (flexor digitorum brevis), המגבילים את טווח התוצאות העוסקות בסוגי סיבים, מגבילים את כמות החומר הביולוגי הזמין ומונעים קשר ברור בין תופעות פיזיולוגיות תאיות לבין ידע ביוכימי ודינמי קודם שהושג בשרירים אחרים.
מאמר זה מתאר כיצד להשיג סיבים שלמים משישה שרירים בעלי פרופילים ואורכים שונים של סוגי סיבים. באמצעות C57BL/6 עכברים בוגרים, אנו מראים את פרוטוקול דיסקציית השרירים ובידוד הסיבים ומדגימים את התאמת הסיבים למחקרים חולפים Ca2+ ואפיונם המורפומטרי. הרכב סוג סיבים של השרירים מוצג גם. כאשר מנותקים, כל השרירים נותרו שלמים, סיבים חיים המתכווצים במהירות במשך יותר מ -24 שעות. FDB נתן קצר (<1 מ"מ), peroneus digiti quarti (PDQA) ו peroneus longus (PL) נתן ביניים (1-3 מ"מ), בעוד extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), ושרירי סולאוס שחררו סיבים ארוכים (3-6 מ"מ).
כאשר תועדו עם הצבע המהיר Mag-Fluo-4, Ca2+ transients של סיבי PDQA, PL ו-EHL הראו קינטיקה מהירה וצרה המזכירה את סוג המורפולוגיה II (MT-II), הידוע כמתאים לסיבים מסוג IIX ו-IIB. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי שרירים אלה יש מעל 90% של סיבים מסוג II לעומת FDB (~ 80%) ו soleus (~ 65%). מעבר ל-FDB, אנו מדגימים לראשונה דיסוציאציה של מספר שרירים, היוצרים סיבים המשתרעים על פני טווח אורכים שבין 1 ל-6 מ"מ. סיבים אלה הם קיימא ונותנים Ca2+ מהיר transients, המציין כי MT-II ניתן להכליל סיבים מהירים IIX ו- IIB, ללא קשר למקור השריר שלהם. תוצאות אלה מגדילות את הזמינות של מודלים למחקרי שרירי שלד בוגרים.
שריר השלד הבוגר של יונקים הוא רקמה רב תכליתית. הוא מווסת בכבדות את חילוף החומרים, הוא המקור העיקרי לייצור חום, ותכונותיו הדינמיות מעניקות לו תפקיד מפתח בנשימה, תנועה של מקטעי גוף, או תזוזה מנקודה אחת לאחרת 1,2,3. שרירי השלד רלוונטיים גם לפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל מצבים תורשתיים וכרוניים, כגון מיופתיות, ניוון או סרקופניה, כמו גם מצבים כרוניים רבים שאינם שרירים, כגון מחלות לב מטבוליות 3,4,5,6,7,8.<....
כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה בניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת אנטיוקיה (UdeA) (פרוטוקול 104 מיום 21 ביוני 2016 ו-005 מיום 15 באפריל 2021), על פי חוק 84 משנת 1989 והחלטה 8430 משנת 1993 שהונפקו על ידי ממשלת קולומביה ובוצעו ודווחו בהתאם למחקר בבעלי חיים: הנחיות דיווח בניסויי Vivo (ARRIVE)
ריכוז סרקופלזמי Ca2+ במהלך עווית
כדי להדגים את ההיתכנות של ניסויים פיזיולוגיים בקבוצת סיבים מנותקים ולהרחיב את הממצאים הקודמים שלנו על צימוד עירור-כיווץ (ECC) וסוגי סיבים, Ca2+ transients נרכשו בסיבים מכל השרירים. ראשית, FDB (n = 5) ו- EDL (n = 7) הראו קינטיקה Ca2+ המכונה מורפולוגיה .......
כדי להשלים את המודלים הזמינים לחקר ביולוגיה של שרירי שלד בוגרים, כאן אנו מדגימים את הדיסוציאציה האנזימטית המוצלחת של מגוון שרירי עכבר עם סיבים קצרים, בינוניים וארוכים. סיבים אלה מאפשרים הדגמה של הכללה של קינטיקה MT-II של Ca2+ transients בשרירי השלד. יתר על כן, סוגי הסיבים בשרירים שלמים שלמים ס.......
המחברים מביעים את תודתם לפרופסור רובינסון רמירז מ-UdeA על העזרה עם בעלי חיים וכמה תמונות ולקרולינה פלאסיוס על התמיכה הטכנית. יוהאן פינדה מקיקה עזר לנו להתקין את מצלמות הצבע והפלורסצנטיות. שיואן נגו, מאוניברסיטת קווינסלנד, הגיה באדיבות את כתב היד. מחקר זה מומן על ידי CODI-UdeA (2020-34909 מה-22 בפברואר 2021, ו-2021-40170 מה-31 במרץ 2022, SIU), ומשרד התכנון UdeA (E01708-K ו-ES03180101), מדיין, קולומביה, ל-JCC. המממנים לא השתתפו באיסוף וניתוח נתונים, בכתיבת כתבי יד או בהגשתם.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Absolute ethanol | Sigma Aldrich | 32221 | |
Acetone | Merck | 179124 | |
Acrylamide | Gibco BRL | 15512-015 | |
Ammonium persulfate | Panreac | 141138.1610 | |
Anti myosin I antibody | Sigma Aldrich | M4276 | Primary antibody |
Anti myosin II antibody | Sigma Aldrich | M8421 | Primary antibody |
Anti myosin IIA antibody | American Type Culture Collection | SC-71 | Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma |
Anti myosin IIB antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | BF-F3-c | Primary antibody |
Bis-acrylamide | AMRESCO | 0172 | |
Bovine serum albumin | Thermo Scientific | B14 | |
Bradford reagent | Merck | 1.10306.0500 | |
Bromophenol blue | Carlo Erba | 428658 | |
Calcium carbonate | Merck | 102066 | |
Calcium dichloride (CaCl2) | Merck | 2389 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 319988 | |
Collagenase type 2 | Worthington | CLS-2/LS004176 | |
Consul-Mount | Thermo Scientific | 9990440 | |
Coomassie Brilliant blue R 250 | Merck | 112553 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Dithiothreitol (DTT) | AMRESCO | 0281 | |
Edetic acid (EDTA | AMRESCO | 0322 | |
Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
Glycerol | Panreac | 1423291211 | |
Glycine | Panreac | 151340.1067 | |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
Hematoxylin | Thermo Scientific | 6765015 | |
HEPES | AMRESCO | 0511 | |
Hoechst 33258 | Sigma Aldrich | 861405 | |
Imidazole | AMRESCO | M136 | |
Isopentane | Sigma Aldrich | M32631 | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
Mag-Fluo-4, AM | Invitrogen | M14206 | Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration. |
Mercaptoethanol | Applichem | A11080100 | |
Methanol | Protokimica | MP10043 | |
Mice | Several | Several | For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight. |
Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Promega | V3161 | |
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Tocris | 1870 | |
Optimal cutting compound (OCT) | Thermo Scientific | 6769006 | |
Secondary antibody | Thermo Scientific | A-11001 | Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Sodium dodecil sulfate | Panreac | 1323631209 | |
TRIS 0.5 M, pH 6.8 | AMRESCO | J832 | |
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane | AMRESCO | M151 | |
Triton X-100 | AMRESCO | M143 | |
Materials | |||
Dissection chamber | Custom-made | ||
Charged slides | Erie Scientific | 5951PLUS | |
Experimental bath chamber | Warner Instruments | RC-27NE2 | Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6 |
Fine forceps | World Precision Instruments | 500338, 500230 | |
Fine scissors | World Precision Instruments | Vannas Scissors 501778 | |
Glass Pasteur pipettes | Several | Fire-polished tips | |
Glass vials with cap | Several | 2-3 mL volumen | |
Operating scissors | World Precision Instruments | 501223-G | |
Equipment | |||
Centrifuge | Thermo Scientific | SL 8R | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Digital camera | Zeiss | Erc 5s and Axio 305 | Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays |
Digitizer | Molecular Devices | 1550A Digidata | |
Electrophoresis chamber | Bio Rad | Mini-Protean IV | |
Inverted microscope coupled to fluorescence | Zeiss | Axio Observer A1 | Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence |
Photomultiplier | Horiba | R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba | Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope |
Stereoscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Stimulator | Grass Instruments | S6 | |
Water bath | Memmert | WNE-22 | |
Xilol | Sigma Aldrich | 808691 | |
Software | |||
Free software for electrophoreses analyses | University of Kentucky | GelBandFitter v1.7 | http://www.gelbandfitter.org |
Free software for image analysis and morphometry | National Institutes of Health | ImageJ v1.54 | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses | Molecular Devices | pCLAMP v10.05 | https://www.moleculardevices.com |
Licensed software for statistical analyses and graphing | OriginLab | OriginPro 2019 | https://www.originlab.com/ |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved