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Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).
Fibras musculares esqueléticas obtidas por dissociação enzimática de músculos de camundongos são um modelo útil para experimentos fisiológicos. No entanto, a maioria dos trabalhos trata das fibras curtas do flexor curto dos dedos (FDB), o que restringe o escopo de resultados que tratam dos tipos de fibras, limita a quantidade de material biológico disponível e impede uma clara conexão entre fenômenos fisiológicos celulares e conhecimentos bioquímicos e dinâmicos prévios obtidos em outros músculos.
Este trabalho descreve como obter fibras intactas de seis músculos com diferentes perfis e comprimentos de tipos de fibras. Usando camundongos adultos C57BL/6, mostramos o protocolo de dissecção muscular e isolamento de fibras e demonstramos a adequação das fibras para estudos transitórios de Ca2+ e sua caracterização morfométrica. A composição do tipo de fibras dos músculos também é apresentada. Quando dissociados, todos os músculos ficaram intactos, fibras vivas que se contraem rapidamente por mais de 24 h. FDB deu curto (<1 mm), fibular dos dedos (PDQA) e fibular longo (PL) deu intermediário (1-3 mm), enquanto extensor longo dos dedos (EDL), extensor longo do hálux (EHL) e músculos sóleo liberaram fibras longas (3-6 mm).
Quando registrados com o corante rápido Mag-Fluo-4, os transientes de Ca2+ das fibras PDQA, PL e EHL mostraram a cinética rápida e estreita que lembra a morfologia tipo II (MT-II), conhecida por corresponder às fibras tipo IIX e IIB. Isso é consistente com o fato de que esses músculos têm mais de 90% de fibras do tipo II em comparação com FDB (~80%) e sóleo (~65%). Indo além do FDB, demonstramos pela primeira vez a dissociação de vários músculos, que tornam fibras que abrangem uma faixa de comprimentos entre 1 e 6 mm. Essas fibras são viáveis e dão rápidos transientes de Ca2+ , indicando que a MT-II pode ser generalizada para fibras rápidas IIX e IIB, independentemente de sua fonte muscular. Esses resultados aumentam a disponibilidade de modelos para estudos do músculo esquelético maduro.
O músculo esquelético maduro de mamíferos é um tecido multifuncional. Regula fortemente o metabolismo, é a principal fonte de produção de calor e suas propriedades dinâmicas lhe conferem papel fundamental na respiração, movimentação de segmentos corporais ou deslocamento de um ponto a outro 1,2,3. O músculo esquelético também é relevante para a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo condições hereditárias e crônicas, como miopatias, distrofias ou sarcopenia, bem como muitas condições crônicas não musculares, como doenças cardiometabólicas
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com animais da Universidade de Antioquia (UdeA) (atas 104 de 21 de junho de 2016 e 005 de 15 de abril de 2021), de acordo com a Lei 84 de 1989 e a Resolução 8430 de 1993 emitida pelo Governo Colombiano e foram realizados e relatados em conformidade com a Pesquisa Animal: Diretrizes de relatórios de experimentos in vivo (ARRIVE)41. Todos os resultados aqui apresentados provêm de camundo.......
Concentração de Ca2+ sarcoplasmático durante uma contração
Para demonstrar a viabilidade de experimentos fisiológicos no conjunto de fibras dissociadas e estender nossos achados anteriores sobre acoplamento excitação-contração (CCE) e tipos de fibras, transientes de Ca2+ foram adquiridos em fibras de todos os músculos. Primeiro, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) apresentaram cinética de Ca2+ conhecida como morfologia tipo II (MT-II). Estes são sinais rápidos, esp.......
Para complementar os modelos disponíveis para o estudo da biologia muscular esquelética madura, demonstramos aqui a dissociação enzimática bem-sucedida de uma variedade de músculos de camundongos com fibras curtas, intermediárias e longas. Essas fibras permitem demonstrar a generalização da cinética MT-II dos transientes de Ca2+ no músculo esquelético. Além disso, os tipos de fibras nos músculos inteiros intactos foram classificados. Tendo em vista que o FDB é o músculo mais utilizado para expe.......
Os autores expressam sua gratidão ao professor Robinson Ramírez, da UdeA, pela ajuda com os animais e algumas fotos e a Carolina Palacios pelo apoio técnico. Johan Pineda da Kaika nos ajudou a configurar as câmeras coloridas e de fluorescência. Shyuan Ngo, da Universidade de Queensland, gentilmente revisou o manuscrito. Este estudo foi financiado pelo CODI-UdeA (2020-34909 de 22 de fevereiro de 2021 e 2021-40170 de 31 de março de 2022, SIU), e pelo Escritório de Planejamento-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colômbia, ao JCC. Os financiadores não participaram da coleta e análise dos dados, redação ou submissão do manuscrito.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Absolute ethanol | Sigma Aldrich | 32221 | |
Acetone | Merck | 179124 | |
Acrylamide | Gibco BRL | 15512-015 | |
Ammonium persulfate | Panreac | 141138.1610 | |
Anti myosin I antibody | Sigma Aldrich | M4276 | Primary antibody |
Anti myosin II antibody | Sigma Aldrich | M8421 | Primary antibody |
Anti myosin IIA antibody | American Type Culture Collection | SC-71 | Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma |
Anti myosin IIB antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | BF-F3-c | Primary antibody |
Bis-acrylamide | AMRESCO | 0172 | |
Bovine serum albumin | Thermo Scientific | B14 | |
Bradford reagent | Merck | 1.10306.0500 | |
Bromophenol blue | Carlo Erba | 428658 | |
Calcium carbonate | Merck | 102066 | |
Calcium dichloride (CaCl2) | Merck | 2389 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 319988 | |
Collagenase type 2 | Worthington | CLS-2/LS004176 | |
Consul-Mount | Thermo Scientific | 9990440 | |
Coomassie Brilliant blue R 250 | Merck | 112553 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Dithiothreitol (DTT) | AMRESCO | 0281 | |
Edetic acid (EDTA | AMRESCO | 0322 | |
Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
Glycerol | Panreac | 1423291211 | |
Glycine | Panreac | 151340.1067 | |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
Hematoxylin | Thermo Scientific | 6765015 | |
HEPES | AMRESCO | 0511 | |
Hoechst 33258 | Sigma Aldrich | 861405 | |
Imidazole | AMRESCO | M136 | |
Isopentane | Sigma Aldrich | M32631 | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
Mag-Fluo-4, AM | Invitrogen | M14206 | Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration. |
Mercaptoethanol | Applichem | A11080100 | |
Methanol | Protokimica | MP10043 | |
Mice | Several | Several | For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight. |
Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Promega | V3161 | |
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Tocris | 1870 | |
Optimal cutting compound (OCT) | Thermo Scientific | 6769006 | |
Secondary antibody | Thermo Scientific | A-11001 | Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Sodium dodecil sulfate | Panreac | 1323631209 | |
TRIS 0.5 M, pH 6.8 | AMRESCO | J832 | |
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane | AMRESCO | M151 | |
Triton X-100 | AMRESCO | M143 | |
Materials | |||
Dissection chamber | Custom-made | ||
Charged slides | Erie Scientific | 5951PLUS | |
Experimental bath chamber | Warner Instruments | RC-27NE2 | Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6 |
Fine forceps | World Precision Instruments | 500338, 500230 | |
Fine scissors | World Precision Instruments | Vannas Scissors 501778 | |
Glass Pasteur pipettes | Several | Fire-polished tips | |
Glass vials with cap | Several | 2-3 mL volumen | |
Operating scissors | World Precision Instruments | 501223-G | |
Equipment | |||
Centrifuge | Thermo Scientific | SL 8R | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Digital camera | Zeiss | Erc 5s and Axio 305 | Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays |
Digitizer | Molecular Devices | 1550A Digidata | |
Electrophoresis chamber | Bio Rad | Mini-Protean IV | |
Inverted microscope coupled to fluorescence | Zeiss | Axio Observer A1 | Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence |
Photomultiplier | Horiba | R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba | Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope |
Stereoscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Stimulator | Grass Instruments | S6 | |
Water bath | Memmert | WNE-22 | |
Xilol | Sigma Aldrich | 808691 | |
Software | |||
Free software for electrophoreses analyses | University of Kentucky | GelBandFitter v1.7 | http://www.gelbandfitter.org |
Free software for image analysis and morphometry | National Institutes of Health | ImageJ v1.54 | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses | Molecular Devices | pCLAMP v10.05 | https://www.moleculardevices.com |
Licensed software for statistical analyses and graphing | OriginLab | OriginPro 2019 | https://www.originlab.com/ |
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