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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Abstract

Fibras musculares esqueléticas obtidas por dissociação enzimática de músculos de camundongos são um modelo útil para experimentos fisiológicos. No entanto, a maioria dos trabalhos trata das fibras curtas do flexor curto dos dedos (FDB), o que restringe o escopo de resultados que tratam dos tipos de fibras, limita a quantidade de material biológico disponível e impede uma clara conexão entre fenômenos fisiológicos celulares e conhecimentos bioquímicos e dinâmicos prévios obtidos em outros músculos.

Este trabalho descreve como obter fibras intactas de seis músculos com diferentes perfis e comprimentos de tipos de fibras. Usando camundongos adultos C57BL/6, mostramos o protocolo de dissecção muscular e isolamento de fibras e demonstramos a adequação das fibras para estudos transitórios de Ca2+ e sua caracterização morfométrica. A composição do tipo de fibras dos músculos também é apresentada. Quando dissociados, todos os músculos ficaram intactos, fibras vivas que se contraem rapidamente por mais de 24 h. FDB deu curto (<1 mm), fibular dos dedos (PDQA) e fibular longo (PL) deu intermediário (1-3 mm), enquanto extensor longo dos dedos (EDL), extensor longo do hálux (EHL) e músculos sóleo liberaram fibras longas (3-6 mm).

Quando registrados com o corante rápido Mag-Fluo-4, os transientes de Ca2+ das fibras PDQA, PL e EHL mostraram a cinética rápida e estreita que lembra a morfologia tipo II (MT-II), conhecida por corresponder às fibras tipo IIX e IIB. Isso é consistente com o fato de que esses músculos têm mais de 90% de fibras do tipo II em comparação com FDB (~80%) e sóleo (~65%). Indo além do FDB, demonstramos pela primeira vez a dissociação de vários músculos, que tornam fibras que abrangem uma faixa de comprimentos entre 1 e 6 mm. Essas fibras são viáveis e dão rápidos transientes de Ca2+ , indicando que a MT-II pode ser generalizada para fibras rápidas IIX e IIB, independentemente de sua fonte muscular. Esses resultados aumentam a disponibilidade de modelos para estudos do músculo esquelético maduro.

Introduction

O músculo esquelético maduro de mamíferos é um tecido multifuncional. Regula fortemente o metabolismo, é a principal fonte de produção de calor e suas propriedades dinâmicas lhe conferem papel fundamental na respiração, movimentação de segmentos corporais ou deslocamento de um ponto a outro 1,2,3. O músculo esquelético também é relevante para a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo condições hereditárias e crônicas, como miopatias, distrofias ou sarcopenia, bem como muitas condições crônicas não musculares, como doenças cardiometabólicas

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com animais da Universidade de Antioquia (UdeA) (atas 104 de 21 de junho de 2016 e 005 de 15 de abril de 2021), de acordo com a Lei 84 de 1989 e a Resolução 8430 de 1993 emitida pelo Governo Colombiano e foram realizados e relatados em conformidade com a Pesquisa Animal: Diretrizes de relatórios de experimentos in vivo (ARRIVE)41. Todos os resultados aqui apresentados provêm de camundo.......

Representative Results

Concentração de Ca2+ sarcoplasmático durante uma contração
Para demonstrar a viabilidade de experimentos fisiológicos no conjunto de fibras dissociadas e estender nossos achados anteriores sobre acoplamento excitação-contração (CCE) e tipos de fibras, transientes de Ca2+ foram adquiridos em fibras de todos os músculos. Primeiro, FDB (n = 5) e EDL (n = 7) apresentaram cinética de Ca2+ conhecida como morfologia tipo II (MT-II). Estes são sinais rápidos, esp.......

Discussion

Para complementar os modelos disponíveis para o estudo da biologia muscular esquelética madura, demonstramos aqui a dissociação enzimática bem-sucedida de uma variedade de músculos de camundongos com fibras curtas, intermediárias e longas. Essas fibras permitem demonstrar a generalização da cinética MT-II dos transientes de Ca2+ no músculo esquelético. Além disso, os tipos de fibras nos músculos inteiros intactos foram classificados. Tendo em vista que o FDB é o músculo mais utilizado para expe.......

Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

Os autores expressam sua gratidão ao professor Robinson Ramírez, da UdeA, pela ajuda com os animais e algumas fotos e a Carolina Palacios pelo apoio técnico. Johan Pineda da Kaika nos ajudou a configurar as câmeras coloridas e de fluorescência. Shyuan Ngo, da Universidade de Queensland, gentilmente revisou o manuscrito. Este estudo foi financiado pelo CODI-UdeA (2020-34909 de 22 de fevereiro de 2021 e 2021-40170 de 31 de março de 2022, SIU), e pelo Escritório de Planejamento-UdeA (E01708-K e ES03180101), Medellín, Colômbia, ao JCC. Os financiadores não participaram da coleta e análise dos dados, redação ou submissão do manuscrito.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Absolute ethanolSigma Aldrich32221
AcetoneMerck179124
AcrylamideGibco BRL15512-015
Ammonium persulfatePanreac141138.1610
Anti myosin I antibodySigma AldrichM4276Primary antibody
Anti myosin II antibodySigma AldrichM8421Primary antibody
Anti myosin IIA antibodyAmerican Type Culture CollectionSC-71Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibodyDevelopmental Studies Hybridoma BankBF-F3-c Primary antibody
Bis-acrylamideAMRESCO0172
Bovine serum albuminThermo ScientificB14
Bradford reagentMerck1.10306.0500
Bromophenol blueCarlo Erba428658
Calcium carbonateMerck102066
Calcium dichloride (CaCl2)Merck2389
ChloroformSigma Aldrich319988
Collagenase type 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Brilliant blue R 250 Merck112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dithiothreitol (DTT)AMRESCO0281
Edetic acid (EDTAAMRESCO0322
Eosin YSigma AldrichE4009
GlycerolPanreac 1423291211
GlycinePanreac151340.1067
Goat serumSigma AldrichG9023
HematoxylinThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazoleAMRESCOM136
IsopentaneSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
MercaptoethanolApplichemA11080100
MethanolProtokimicaMP10043
MiceSeveralSeveralFor this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)PromegaV3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)Tocris1870
Optimal cutting compound (OCT)Thermo Scientific6769006
Secondary antibodyThermo ScientificA-11001Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfatePanreac 1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8 AMRESCOJ832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethaneAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materials
Dissection chamberCustom-made
Charged slidesErie Scientific5951PLUS
Experimental bath chamberWarner InstrumentsRC-27NE2Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forcepsWorld Precision Instruments500338, 500230
Fine scissorsWorld Precision InstrumentsVannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettesSeveralFire-polished tips
Glass vials with capSeveral2-3 mL volumen
Operating scissorsWorld Precision Instruments501223-G
Equipment
CentrifugeThermo ScientificSL 8R
Confocal microscopeOlympusFV1000
CryostatLeicaCM1850
Digital cameraZeissErc 5s and Axio 305Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Electrophoresis chamberBio RadMini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescenceZeissAxio Observer A1Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
PhotomultiplierHoribaR928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, HoribaCoupled to the lateral port of the fluorescence microscope
StereoscopeZeissStemi 508
Stimulator Grass Instruments S6
Water bath MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Free software for electrophoreses analysesUniversity of KentuckyGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometryNational Institutes of HealthImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analysesMolecular DevicespCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphingOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J M....

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