Интактные короткие, промежуточные и длинные скелетные мышечные волокна, полученные ферментативной диссоциацией шести мышц задних конечностей мышей: за пределами сгибателя пальцев (Beyond Flexor Digitorum Brevis)

Summary

Описан протокол получения ферментативно диссоциированных волокон разной длины и типа из шести мышц взрослых мышей: трех из них уже описанных (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) и трех из них успешно диссоциированных впервые (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

Скелетные мышечные волокна, полученные путем ферментативной диссоциации мышц мышей, являются полезной моделью для физиологических экспериментов. Тем не менее, большинство работ имеют дело с короткими волокнами короткого сгибателя пальцев (FDB), что ограничивает область результатов, связанных с типами волокон, ограничивает количество доступного биологического материала и препятствует четкой связи между клеточными физиологическими явлениями и предыдущими биохимическими и динамическими знаниями, полученными в других мышцах.

В данной работе описывается, как получить неповрежденные волокна из шести мышц с различными профилями и длинами волокон. Используя взрослых мышей C57BL/6, мы показали протокол рассечения мышц и изоляции волокон, а также продемонстрировали пригодность волокон для транзиентных исследований Ca2⁺ и их морфометрической характеристики. Также представлен волокнистый состав мышц. При диссоциации все мышцы становились неповрежденными, живые волокна, которые быстро сокращались более 24 ч. FDB давали короткие (<1 мм), peroneus digiti quarti (PDQA) и peroneus longus (PL) давали промежуточные (1-3 мм), в то время как разгибатели пальцев (EDL), разгибатели галлюциса (EHL) и камбаловидные мышцы высвобождали длинные (3-6 мм) волокна.

При регистрации с помощью быстрого красителя Mag-Fluo-4 переходные процессы Ca²⁺ волокон PDQA, PL и EHL показали быструю, узкую кинетику, напоминающую морфологию типа II (MT-II), которая, как известно, соответствует волокнам типа IIX и IIB. Это согласуется с тем фактом, что эти мышцы имеют более 90% волокон II типа по сравнению с FDB (~80%) и камбаловидной мышцей (~65%). Выйдя за рамки FDB, мы впервые продемонстрировали диссоциацию нескольких мышц, которые выделяют волокна длиной от 1 до 6 мм. Эти волокна жизнеспособны и дают быстрые транзиенты^Ca2+ , что указывает на то, что MT-II может быть обобщен на быстрые волокна IIX и IIB, независимо от их мышечного источника. Эти результаты повышают доступность моделей для исследований зрелых скелетных мышц.

Introduction

Зрелая скелетная мускулатура млекопитающих является многофункциональной тканью. Он в значительной степени регулирует обмен веществ, является основным источником теплообразования, а его динамические свойства наделяют его ключевой ролью в дыхании, движении сегментов тела или перемещении из одной точки^в другую1,2,3. Скелетные мышцы также важны для патофизиологии многих заболеваний, включая наследственные и хронические состояния, такие как миопатии, дистрофии или саркопения, а также многие немышечные хронические состояния, такие как кардиометаболические заболевания

Protocol

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике в экспериментах на животных Университета Антьокии (UdeA) (протоколы 104 от 21 июня 2016 г. и 005 от 15 апреля 2021 г.), в соответствии с Законом 84 от 1989 г. и Резолюцией 8430 от 1993 г^., изданной правительством Колумбии, и были выполнены и представлен.......

Discussion

В дополнение к моделям, доступным для изучения биологии зрелых скелетных мышц, мы демонстрируем успешную ферментативную диссоциацию ряда мышц мышей с короткими, промежуточными и длинными волокнами. Эти волокна позволяют продемонстрировать обобщаемость кинетики MT-II переходных процес.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/