Dissociação mecânica de tecidos para análise unicelular utilizando dispositivo motorizado

Summary

Um protocolo geral para a dissociação mecânica enzimática e semi-automatizada combinada de tecidos para gerar suspensões unicelulares para análises a jusante, como citometria de fluxo, é fornecido. Instruções para a fabricação, montagem e operação do dispositivo mecânico de baixo custo desenvolvido para este protocolo estão incluídas.

Abstract

Ser capaz de isolar e preparar células únicas para a análise de amostras de tecido tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas e pesquisas biomédicas. Protocolos manuais para isolamentos de célula única são altamente demorados e propensos à variabilidade do usuário. Os protocolos mecânicos automatizados são capazes de reduzir o tempo de processamento e a variabilidade da amostra, mas não são facilmente acessíveis ou econômicos em ambientes de pesquisa com menos recursos. O dispositivo aqui descrito foi projetado para dissociação tecidual semi-automatizada usando materiais disponíveis comercialmente como uma alternativa de baixo custo para laboratórios acadêmicos. Instruções para fabricar, montar e operar o design do dispositivo foram fornecidas. O protocolo de dissociação produz suspensões de célula única de forma confiável com rendimentos celulares comparáveis e viabilidade de amostra para preparações manuais em vários tecidos de camundongos. O protocolo fornece a capacidade de processar até 12 amostras de tecido simultaneamente por dispositivo, tornando os estudos que exigem grandes tamanhos de amostra mais gerenciáveis. O software que o acompanha também permite a personalização do protocolo do dispositivo para acomodar tecidos variados e restrições experimentais.

Introduction

A análise unicelular tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas biomédicas, seja para aplicações como citometria de fluxo, identificação de diferentes tipos celulares, sequenciamento unicelular, seja para identificar variações genômicas ou transcriptômicas entre células¹. A realização desses isolamentos celulares a partir de tecidos de interesse requer a picagem de tecidos dissecados e empurrá-los através de um filtro de células finas para filtrar o tecido conjuntivo das células desejadas (Figura 1A). O isolamento de tipos celulares aderentes, como células dendríticas ou macrófagos, ou células de tecidos ....

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UMD (IACUC). Tecidos de camundongos fêmeas C57BL/6J de 7 a 9 semanas de idade foram usados para esses estudos. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Dissociação manual

NOTA: Esta etapa é adaptada de Maisel K. et ^al.7.

1. Retirar o tecido dissecado e colocá-lo em meio de cultur.......

Discussion

Este dispositivo foi projetado para fácil montagem no ambiente de pesquisa para fornecer suspensões de célula única de tecidos inteiros para posterior análise de célula única. Os recursos, embora básicos, são suficientes para atender às necessidades de pesquisadores em ambientes acadêmicos e além. Um dos principais benefícios do uso deste dispositivo é seu potencial para melhorar a preparação de suspensões de célula única, reduzindo a variabilidade. Além disso, a capacidade de processar 12+ amostras s.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3