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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Abstract

Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.

Introduction

Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas1. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se....

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolos AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) em camundongos fêmeas BALB/c ou CF57BL/6 com 6-8 semanas de idade, pesando entre 20-25 g. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este protocolo é estruturado em torno dos "dias pós-ativação" das células T murinas, e a produção viral começa no Dia -2. O retrovírus pode ser armazenado a -80 °.......

Representative Results

O protocolo aqui descrito visa padronizar o processo de transdução de células T murinas para a geração de células CAR-T de camundongo. A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas. O processo começa com a produção de vetores retrovirais via co-transfecção de componentes virais em células Phoenix Eco. A Figura 2 fornece uma imagem da densidade ideal de células Phoenix Eco no dia da transfecção. As células T isoladas .......

Discussion

Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.

Enquanto este protocolo descreve a geração de exemp.......

Acknowledgements

Agradecemos a L. Brockmann pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filtersMilliporeSigmaSLHVR33RS
1 mL syringe Fisher Scientific 14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-135
10 mL syringe BD14-823-16E
100 μm strainerCorning07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishesThermoFisher Scientific 130183
15 mL conical tubes Falcon14-959-70C
40 μm strainer Corning07-201-430
50 mL conical tubes Falcon14-959-49A
70 μm strainerCorning07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old Jackson Laboratory651
B-Mercaptoethanol Gibco21985023
Bovine Serum Albumin GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium Gibco14-190-250
DynaMag-2 Magnet Invitrogen12-321-D
EasySep Magnet Stemcell Technologies18000
EasySep Mouse T cell Isolation KitStemcell Technologies19851
FACS buffer BDBDB554657
Fetal bovine serum (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
HEPES Buffer Solution Gibco15-630-080
Human recombinant IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Human recombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Human recombinant IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421Biolegend100228
Mouse Anti-CD3/CD28 DynabeadsGibco11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605BD563151
Mouse Anti-CD44 APC Biolegend103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera Nikon
Non-treated 24 well plates CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Penicillin/Streptomycin SolutionGibco15-070-063
Phoenix Eco cellsATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zN/AProduced by R.LV.
Purified sfGFPN/AProduced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Serological pipette 10 mLFisher Scientific 13-678-11E
Serological pipette 25 mLFisher Scientific 13-678-11
Serological pipette 5 mLFisher Scientific 13-678-11D
Sodium PyruvateGibco11-360-070
TC-treated 24 well plates Corning08-772-1
Trypan blue Gibco15-250-061

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Meth....

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