Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Summary

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Abstract

Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.

Introduction

Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas¹. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se....

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolos AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) em camundongos fêmeas BALB/c ou CF57BL/6 com 6-8 semanas de idade, pesando entre 20-25 g. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este protocolo é estruturado em torno dos "dias pós-ativação" das células T murinas, e a produção viral começa no Dia -2. O retrovírus pode ser armazenado a -80 °.......

Discussion

Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.

Enquanto este protocolo descreve a geração de exemp.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061