Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.

Abstract

Инженерная клеточная терапия с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток достигла замечательной эффективности у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время разрабатывается для лечения различных солидных опухолей. До сих пор предварительная оценка новых продуктов CAR-T-клеток проводилась преимущественно на моделях ксенотрансплантатов опухолей с использованием мышей с иммунодефицитом. Этот подход выбран для того, чтобы способствовать успешному приживлению CAR-T-клеток человека в экспериментальных условиях. Тем не менее, сингенные мышиные модели, в которых опухоли и CAR-T-клетки получены из одной и той же линии мышей, позволяют оценивать новые технологии CAR в контексте функциональной иммунной системы и комплексного опухолевого микроокружения (TME). Протокол, описанный здесь, направлен на оптимизацию процесса генерации мышиных CAR-T-клеток путем представления стандартизированных методов ретровирусной трансдукции и культуры ex vivo Т-клеток. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые использовались в данном исследовании, чтобы обеспечить рутинную оценку новых технологий CAR в иммунокомпетентных системах.

Introduction

Адоптивная Т-клеточная терапия, экспрессирующая химерные антигенные рецепторы (CAR), произвела революцию в области иммунотерапии рака, используя возможности адаптивной иммунной системы для специфического нацеливания и уничтожения антиген-позитивных раковыхклеток. В то время как успех терапии CAR-T-клетками, направленной на злокачественные опухоли В-клеток, был клинически подтвержден, доклинические исследования, проведенные на животных моделях, остаются жизненно важными для разработки новых CAR, нацеленных на солидные опухоли. Тем не менее, до сих пор была продемонстрирована ограниченная клиническая эффективность при солидн....

Protocol

Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (Колумбийский университет, протоколы AC-AABQ5551 и AC-AAAZ4470) с использованием 6-8-недельных самок мышей BALB/c или CF57BL/6 весом от 20 до 25 г. Животные были получены из коммерческого ?.......

Representative Results

Протокол, описанный здесь, направлен на стандартизацию процесса трансдукции мышиных Т-клеток для получения мышиных CAR-T-клеток. На рисунке 1 приведено подробное описание необходимых шагов. Процесс начинается с производства ретровирусных векторов путем котрансфекц.......

Discussion

Этот протокол описывает этапы и реагенты, необходимые для ретровирусной трансдукции мышиных Т-клеток для получения CAR-T-клеток для исследований in vivo . Оптимизация условий ретровирусной трансдукции позволяет достичь устойчивой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с.......

Acknowledgements

Благодарим Л. Брокмана за критическое рецензирование рукописи. Эта работа была поддержана NIH 1R01EB030352 и UL1 TR001873.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filtersMilliporeSigmaSLHVR33RS
1 mL syringe Fisher Scientific 14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-135
10 mL syringe BD14-823-16E
100 μm strainerCorning07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishesThermoFisher Scientific 130183
15 mL conical tubes Falcon14-959-70C
40 μm strainer Corning07-201-430
50 mL conical tubes Falcon14-959-49A
70 μm strainerCorning07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old Jackson Laboratory651
B-Mercaptoethanol Gibco21985023
Bovine Serum Albumin GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium Gibco14-190-250
DynaMag-2 Magnet Invitrogen12-321-D
EasySep Magnet Stemcell Technologies18000
EasySep Mouse T cell Isolation KitStemcell Technologies19851
FACS buffer BDBDB554657
Fetal bovine serum (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
HEPES Buffer Solution Gibco15-630-080
Human recombinant IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Human recombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Human recombinant IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421Biolegend100228
Mouse Anti-CD3/CD28 DynabeadsGibco11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605BD563151
Mouse Anti-CD44 APC Biolegend103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera Nikon
Non-treated 24 well plates CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Penicillin/Streptomycin SolutionGibco15-070-063
Phoenix Eco cellsATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zN/AProduced by R.LV.
Purified sfGFPN/AProduced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Serological pipette 10 mLFisher Scientific 13-678-11E
Serological pipette 25 mLFisher Scientific 13-678-11
Serological pipette 5 mLFisher Scientific 13-678-11D
Sodium PyruvateGibco11-360-070
TC-treated 24 well plates Corning08-772-1
Trypan blue Gibco15-250-061

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Meth....

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved