A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.
Инженерная клеточная терапия с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток достигла замечательной эффективности у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время разрабатывается для лечения различных солидных опухолей. До сих пор предварительная оценка новых продуктов CAR-T-клеток проводилась преимущественно на моделях ксенотрансплантатов опухолей с использованием мышей с иммунодефицитом. Этот подход выбран для того, чтобы способствовать успешному приживлению CAR-T-клеток человека в экспериментальных условиях. Тем не менее, сингенные мышиные модели, в которых опухоли и CAR-T-клетки получены из одной и той же линии мышей, позволяют оценивать новые технологии CAR в контексте функциональной иммунной системы и комплексного опухолевого микроокружения (TME). Протокол, описанный здесь, направлен на оптимизацию процесса генерации мышиных CAR-T-клеток путем представления стандартизированных методов ретровирусной трансдукции и культуры ex vivo Т-клеток. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые использовались в данном исследовании, чтобы обеспечить рутинную оценку новых технологий CAR в иммунокомпетентных системах.
Адоптивная Т-клеточная терапия, экспрессирующая химерные антигенные рецепторы (CAR), произвела революцию в области иммунотерапии рака, используя возможности адаптивной иммунной системы для специфического нацеливания и уничтожения антиген-позитивных раковыхклеток. В то время как успех терапии CAR-T-клетками, направленной на злокачественные опухоли В-клеток, был клинически подтвержден, доклинические исследования, проведенные на животных моделях, остаются жизненно важными для разработки новых CAR, нацеленных на солидные опухоли. Тем не менее, до сих пор была продемонстрирована ограниченная клиническая эффективность при солидн....
Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (Колумбийский университет, протоколы AC-AABQ5551 и AC-AAAZ4470) с использованием 6-8-недельных самок мышей BALB/c или CF57BL/6 весом от 20 до 25 г. Животные были получены из коммерческого ?.......
Протокол, описанный здесь, направлен на стандартизацию процесса трансдукции мышиных Т-клеток для получения мышиных CAR-T-клеток. На рисунке 1 приведено подробное описание необходимых шагов. Процесс начинается с производства ретровирусных векторов путем котрансфекц.......
Этот протокол описывает этапы и реагенты, необходимые для ретровирусной трансдукции мышиных Т-клеток для получения CAR-T-клеток для исследований in vivo . Оптимизация условий ретровирусной трансдукции позволяет достичь устойчивой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с.......
Благодарим Л. Брокмана за критическое рецензирование рукописи. Эта работа была поддержана NIH 1R01EB030352 и UL1 TR001873.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
FACS buffer | BD | BDB554657 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved