Эффективная генерация мышиных химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток

Summary

Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.

Abstract

Инженерная клеточная терапия с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток достигла замечательной эффективности у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время разрабатывается для лечения различных солидных опухолей. До сих пор предварительная оценка новых продуктов CAR-T-клеток проводилась преимущественно на моделях ксенотрансплантатов опухолей с использованием мышей с иммунодефицитом. Этот подход выбран для того, чтобы способствовать успешному приживлению CAR-T-клеток человека в экспериментальных условиях. Тем не менее, сингенные мышиные модели, в которых опухоли и CAR-T-клетки получены из одной и той же линии мышей, позволяют оценивать новые технологии CAR в контексте функциональной иммунной системы и комплексного опухолевого микроокружения (TME). Протокол, описанный здесь, направлен на оптимизацию процесса генерации мышиных CAR-T-клеток путем представления стандартизированных методов ретровирусной трансдукции и культуры ex vivo Т-клеток. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые использовались в данном исследовании, чтобы обеспечить рутинную оценку новых технологий CAR в иммунокомпетентных системах.

Introduction

Адоптивная Т-клеточная терапия, экспрессирующая химерные антигенные рецепторы (CAR), произвела революцию в области иммунотерапии рака, используя возможности адаптивной иммунной системы для специфического нацеливания и уничтожения антиген-позитивных раковых^{клеток.} В то время как успех терапии CAR-T-клетками, направленной на злокачественные опухоли В-клеток, был клинически подтвержден, доклинические исследования, проведенные на животных моделях, остаются жизненно важными для разработки новых CAR, нацеленных на солидные опухоли. Тем не менее, до сих пор была продемонстрирована ограниченная клиническая эффективность при солидн....

Protocol

Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (Колумбийский университет, протоколы AC-AABQ5551 и AC-AAAZ4470) с использованием 6-8-недельных самок мышей BALB/c или CF57BL/6 весом от 20 до 25 г. Животные были получены из коммерческого ?.......

Discussion

Этот протокол описывает этапы и реагенты, необходимые для ретровирусной трансдукции мышиных Т-клеток для получения CAR-T-клеток для исследований in vivo . Оптимизация условий ретровирусной трансдукции позволяет достичь устойчивой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061