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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.

Abstract

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são fontes celulares superiores para terapia de reposição celular em indivíduos com doenças degenerativas da retina; no entanto, estudos sobre o armazenamento estável e seguro dessas células terapêuticas são escassos. A viabilidade celular altamente variável e a recuperação funcional das células RPE após a criopreservação são os problemas mais comumente encontrados. No presente protocolo, nosso objetivo foi alcançar a melhor taxa de recuperação celular após o descongelamento, selecionando a fase celular ideal para congelamento com base nas condições experimentais originais. As células foram congeladas na fase exponencial determinada usando o ensaio de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina, que melhorou a viabilidade celular e a taxa de recuperação após o descongelamento. Células estáveis e funcionais foram obtidas logo após o descongelamento, independentemente de um longo processo de diferenciação. Os métodos descritos aqui permitem a preservação e descongelamento simples, eficientes e baratos de células RPE derivadas de hESC. Embora este protocolo se concentre em células RPE, essa estratégia de congelamento pode ser aplicada a muitos outros tipos de células diferenciadas.

Introduction

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada pigmentada de células necessárias para manter o funcionamento adequado da retina1. A disfunção e a morte do EPR estão intimamente associadas a muitas doenças degenerativas da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e doença de Stargardt 2,3. A terapia de reposição do EPR é um dos esquemas de tratamento mais promissores para essas doenças 4,5,6,7. Um suprimento estável ....

Protocol

1. Dissociação celular

  1. Manter as células EPR conforme descrito anteriormente 17,22.
    NOTA: Todas as células são cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO2 durante toda a duração dos protocolos.
  2. Prepare a quantidade necessária de PBS e meio de cultura em banho-maria a 37 ° C e coloque o reagente de dissociação celular em temperatura ambiente.
  3. Descarte a solução de cultura e lave as pl.......

Representative Results

Aqui, células RPE derivadas de hESC em P1D35 foram passadas e semeadas a uma densidade de 105 / cm2. Dentro de uma semana após a semeadura, a morfologia hexagonal característica e a pigmentação foram perdidas durante a fase de latência (aproximadamente 2 dias). As células RPE gradualmente readotaram a morfologia hexagonal na fase exponencial (aproximadamente 5 dias, Figura 1A) e entraram na fase de desaceleração (aproximadamente 6 dias) com uma morfologia mais .......

Discussion

No presente estudo, é descrito um protocolo de congelamento e descongelamento bem-sucedido para células RPE derivadas de hESC para pesquisa e necessidades clínicas. Ao contrário da linhagem celular RPE imortalizada, ARPE-19, as células RPE com fenótipo epitelial e função característicos adequados, como as células RPE derivadas de células-tronco, são mais sensíveis à criopreservação. Menos de 32% das células permaneceram 24 h após o descongelamento, se não forem adequadamente preservadas

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81970816) para Mei Jiang; a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82201223) para Xinyue Zhu; e o Plano de Ação de Inovação em Ciência e Tecnologia da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai (2014090067000) para Haiyun Liu.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40 μm Cell strainerCorning431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 DyeThermo Fisher ScientificC10337
Cryo freezing containerNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
GenxinSelcellYB050050cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cellsprovided by Wicell, USAH9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified MatrixCorning354277basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing SystemBioLife SolutionsAST-601
Trypan Blue solution 0.4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Scientific12563029cell dissociation reagent
XVIVO-10 mediumLonzaBEBP04-743QRPE culture medium
Y-27632SelleckS1049

References

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt ....

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