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* These authors contributed equally
Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.
As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são fontes celulares superiores para terapia de reposição celular em indivíduos com doenças degenerativas da retina; no entanto, estudos sobre o armazenamento estável e seguro dessas células terapêuticas são escassos. A viabilidade celular altamente variável e a recuperação funcional das células RPE após a criopreservação são os problemas mais comumente encontrados. No presente protocolo, nosso objetivo foi alcançar a melhor taxa de recuperação celular após o descongelamento, selecionando a fase celular ideal para congelamento com base nas condições experimentais originais. As células foram congeladas na fase exponencial determinada usando o ensaio de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina, que melhorou a viabilidade celular e a taxa de recuperação após o descongelamento. Células estáveis e funcionais foram obtidas logo após o descongelamento, independentemente de um longo processo de diferenciação. Os métodos descritos aqui permitem a preservação e descongelamento simples, eficientes e baratos de células RPE derivadas de hESC. Embora este protocolo se concentre em células RPE, essa estratégia de congelamento pode ser aplicada a muitos outros tipos de células diferenciadas.
O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada pigmentada de células necessárias para manter o funcionamento adequado da retina1. A disfunção e a morte do EPR estão intimamente associadas a muitas doenças degenerativas da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e doença de Stargardt 2,3. A terapia de reposição do EPR é um dos esquemas de tratamento mais promissores para essas doenças 4,5,6,7. Um suprimento estável ....
1. Dissociação celular
Aqui, células RPE derivadas de hESC em P1D35 foram passadas e semeadas a uma densidade de 105 / cm2. Dentro de uma semana após a semeadura, a morfologia hexagonal característica e a pigmentação foram perdidas durante a fase de latência (aproximadamente 2 dias). As células RPE gradualmente readotaram a morfologia hexagonal na fase exponencial (aproximadamente 5 dias, Figura 1A) e entraram na fase de desaceleração (aproximadamente 6 dias) com uma morfologia mais .......
No presente estudo, é descrito um protocolo de congelamento e descongelamento bem-sucedido para células RPE derivadas de hESC para pesquisa e necessidades clínicas. Ao contrário da linhagem celular RPE imortalizada, ARPE-19, as células RPE com fenótipo epitelial e função característicos adequados, como as células RPE derivadas de células-tronco, são mais sensíveis à criopreservação. Menos de 32% das células permaneceram 24 h após o descongelamento, se não forem adequadamente preservadas
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81970816) para Mei Jiang; a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82201223) para Xinyue Zhu; e o Plano de Ação de Inovação em Ciência e Tecnologia da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai (2014090067000) para Haiyun Liu.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
40 μm Cell strainer | Corning | 431750 | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
Cryo freezing container | Nalgene | 5100-0001 | |
CryoStor CS10 | Biolife Solutions | 07930 | cryopreservation medium #1 |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Genxin | Selcell | YB050050 | cryopreservation medium #2 |
Human embryonic stem cells | provided by Wicell, USA | H9 cell line | |
Matrigel, hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | basement membrane matrix |
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System | BioLife Solutions | AST-601 | |
Trypan Blue solution 0.4% | Sigma | T8154 | |
TryPLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | cell dissociation reagent |
XVIVO-10 medium | Lonza | BEBP04-743Q | RPE culture medium |
Y-27632 | Selleck | S1049 |
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