Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Summary

Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.

Abstract

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são fontes celulares superiores para terapia de reposição celular em indivíduos com doenças degenerativas da retina; no entanto, estudos sobre o armazenamento estável e seguro dessas células terapêuticas são escassos. A viabilidade celular altamente variável e a recuperação funcional das células RPE após a criopreservação são os problemas mais comumente encontrados. No presente protocolo, nosso objetivo foi alcançar a melhor taxa de recuperação celular após o descongelamento, selecionando a fase celular ideal para congelamento com base nas condições experimentais originais. As células foram congeladas na fase exponencial determinada usando o ensaio de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina, que melhorou a viabilidade celular e a taxa de recuperação após o descongelamento. Células estáveis e funcionais foram obtidas logo após o descongelamento, independentemente de um longo processo de diferenciação. Os métodos descritos aqui permitem a preservação e descongelamento simples, eficientes e baratos de células RPE derivadas de hESC. Embora este protocolo se concentre em células RPE, essa estratégia de congelamento pode ser aplicada a muitos outros tipos de células diferenciadas.

Introduction

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada pigmentada de células necessárias para manter o funcionamento adequado da retina¹. A disfunção e a morte do EPR estão intimamente associadas a muitas doenças degenerativas da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e doença de Stargardt ^2,3. A terapia de reposição do EPR é um dos esquemas de tratamento mais promissores para essas doenças 4,5,6,7. Um suprimento estável ....

Protocol

1. Dissociação celular

1. Manter as células EPR conforme descrito anteriormente ^17,22.
   NOTA: Todas as células são cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO₂ durante toda a duração dos protocolos.
2. Prepare a quantidade necessária de PBS e meio de cultura em banho-maria a 37 ° C e coloque o reagente de dissociação celular em temperatura ambiente.
3. Descarte a solução de cultura e lave as pl.......

Discussion

No presente estudo, é descrito um protocolo de congelamento e descongelamento bem-sucedido para células RPE derivadas de hESC para pesquisa e necessidades clínicas. Ao contrário da linhagem celular RPE imortalizada, ARPE-19, as células RPE com fenótipo epitelial e função característicos adequados, como as células RPE derivadas de células-tronco, são mais sensíveis à criopreservação. Menos de 32% das células permaneceram 24 h após o descongelamento, se não forem adequadamente preservadas

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell strainer	Corning	431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye	Thermo Fisher Scientific	C10337
Cryo freezing container	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells	provided by Wicell, USA	H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System	BioLife Solutions	AST-601
Trypan Blue solution 0.4%	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium	Lonza	BEBP04-743Q	RPE culture medium
Y-27632	Selleck	S1049