Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Abstract

Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.

Introduction

Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias....

Protocol

Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de .......

Discussion

O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhal^adulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura c.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G