Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Abstract

Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.

Introduction

Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias....

Protocol

Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de .......

Representative Results

Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA.

Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células iso.......

Discussion

O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura c.......

Acknowledgements

Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolSigma AldrichT48402
24 well tissue culture plateAvantor10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DihydrochlorideInvitrogenD13061:1000
45% glucose solutionCorning25-037-CI
5 mL capped tubesEppendorf30122305
Acetic acidSigma-AdlrichA6283
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead KitMiltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µm filterSysmex Partec04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)Hausser Scientific Co3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichD4527-40KU
Distilled waterTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
DNase for RNA purificationQiagen79254
Dulbecco's phosphate-buffered salineThermo Fisher14040117
Fetal bovine serumThermo FisherA5209401
GFAP antibody (mouse)Santa Cruzsc-336731:500
GFAP antibody (rabbit)DakoZ03341:500
Goat anti-mouse 594 IgGInvitrogena110321:500
Goat anti-mouse 594 IgMInvitrogena210441:300
Goat anti-Rabbit 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 antibody (rabbit)Wako019-19741:500
MACS SeparatorMiltenyi130-042-303
Masterflex C/L Pump SystemThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
MethanolSigma-Adlrich439193
Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000-10
MS ColumnsMiltenyi130-042-401
O4 AntibodyR&DMAB1326
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Plugged 9" glass pasteur pipetteVWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10Fisher scientific22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blo....

Explore More Articles

Este m s em JoVEEdi o 200MicrogliaCamundongo AdultoMedula EspinhalEnsaios In VitroEstudos micosSistema Nervoso CentralDesenvolvimentoRespostas a Les esDoen as NeurodegenerativasC lulas Din micasAltera es AmbientaisMorfologiaPerfis TranscricionaisFun esC lulas GliaisSa de e Doen aAn lises Celulares Espec ficas In VitroCondi es Patol gicasPontos de Tempo Espec ficosIsolamento Espec fico da Medula EspinhalExclus o de Envolvimento CerebralPatologias da Medula EspinhalExperimental Encefalomielite AutoimuneLes o MedularEsclerose Lateral Amiotr fica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved