A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.
Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.
Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias....
Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de .......
Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA.
Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células iso.......
O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura c.......
Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
Distilled water | TMO | 15230001 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
MEM | Corning | 15-015-CV | |
Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved