Elettrodeformazione modulata in ampiezza per valutare la fatica meccanica delle cellule biologiche

Summary

Presentato qui è un protocollo per i test di fatica meccanica nel caso dei globuli rossi umani utilizzando un approccio di elettrodeformazione modulata in ampiezza. Questo approccio generale può essere utilizzato per misurare i cambiamenti sistematici nelle caratteristiche morfologiche e biomeccaniche delle cellule biologiche in una sospensione da deformazione ciclica.

Abstract

I globuli rossi (RBC) sono noti per la loro notevole deformabilità. Subiscono ripetutamente una notevole deformazione quando passano attraverso il microcircolo. La ridotta deformabilità è osservata nei globuli rossi fisiologicamente invecchiati. Le tecniche esistenti per misurare la deformabilità cellulare non possono essere facilmente utilizzate per misurare la fatica, la graduale degradazione nelle membrane cellulari causata da carichi ciclici. Presentiamo un protocollo per valutare la degradazione meccanica nei globuli rossi da sollecitazioni di taglio cicliche utilizzando l'elettrodeformazione basata sulla modulazione ASK (Amplitude Shift Keying) in un canale microfluidico. In breve, gli elettrodi interdigitati nel canale microfluidico sono eccitati con una corrente alternata a bassa tensione a frequenze radio utilizzando un generatore di segnale. I globuli rossi in sospensione rispondono al campo elettrico e mostrano una dielettroforesi positiva (DEP), che sposta le cellule verso i bordi degli elettrodi. Le cellule vengono quindi allungate a causa delle forze elettriche esercitate sulle due metà delle cellule, con conseguente allungamento uniassiale, noto come elettrodeformazione. Il livello di sollecitazione di taglio e la deformazione risultante possono essere facilmente regolati modificando l'ampiezza dell'onda di eccitazione. Ciò consente di quantificare la deformabilità non lineare dei globuli rossi in risposta a piccole e grandi deformazioni ad alta produttività. La modifica dell'onda di eccitazione con la strategia ASK induce elettrodeformazione ciclica con velocità di carico e frequenze programmabili. Ciò fornisce un modo conveniente per la caratterizzazione della fatica dei globuli rossi. Il nostro approccio di elettrodeformazione modulato ASK consente, per la prima volta, una misurazione diretta della fatica dei globuli rossi da carichi ciclici. Può essere utilizzato come strumento per test biomeccanici generali, per analisi della deformabilità cellulare e della fatica in altri tipi di cellule e condizioni patologiche, e può anche essere combinato con strategie per controllare il microambiente delle cellule, come la tensione dell'ossigeno e segnali biologici e chimici.

Introduction

I globuli rossi (RBC) sono le cellule più deformabili nel corpo umano¹. La loro deformabilità è direttamente correlata alla loro funzionalità di trasporto dell'ossigeno. È stato riscontrato che una ridotta deformabilità nei globuli rossi è correlata alla patogenesi di diversi disturbi dei globuli rossi². Le misurazioni della deformabilità ci hanno portato a una migliore comprensione delle malattie correlate ai globuli rossi³. La durata normale dei globuli rossi può variare da 70 a 140 giorni⁴. Pertanto, è importante misurare come la loro deformabilità diminuisce insieme al ....

Protocol

Il sangue intero umano non identificato è stato ottenuto commercialmente. Il lavoro che coinvolge i campioni di sangue è stato eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza presso la Florida Atlantic University.

1. Preparazione del dispositivo microfluidico

1. Fissare con nastro adesivo il wafer di silicio master SU-8 per il design del canale microfluidico all'interno di una caps.......

Discussion

La modulazione ASK OOK di un'onda sinusoidale che induce forza DEP può essere utilizzata per testare la fatica meccanica dei globuli rossi per un lungo periodo di tempo. In questo protocollo, abbiamo limitato il test di fatica in vitro a 1 ora per prevenire i potenziali effetti metabolici avversi sulla deformabilità cellulare. Le condizioni complete di prova di fatica possono essere programmate utilizzando la tecnica di elettrodeformazione modulata ASK. È possibile programmare parametri come la frequenza di caricament.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"