Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Presentato qui è un protocollo per i test di fatica meccanica nel caso dei globuli rossi umani utilizzando un approccio di elettrodeformazione modulata in ampiezza. Questo approccio generale può essere utilizzato per misurare i cambiamenti sistematici nelle caratteristiche morfologiche e biomeccaniche delle cellule biologiche in una sospensione da deformazione ciclica.

Abstract

I globuli rossi (RBC) sono noti per la loro notevole deformabilità. Subiscono ripetutamente una notevole deformazione quando passano attraverso il microcircolo. La ridotta deformabilità è osservata nei globuli rossi fisiologicamente invecchiati. Le tecniche esistenti per misurare la deformabilità cellulare non possono essere facilmente utilizzate per misurare la fatica, la graduale degradazione nelle membrane cellulari causata da carichi ciclici. Presentiamo un protocollo per valutare la degradazione meccanica nei globuli rossi da sollecitazioni di taglio cicliche utilizzando l'elettrodeformazione basata sulla modulazione ASK (Amplitude Shift Keying) in un canale microfluidico. In breve, gli elettrodi interdigitati nel canale microfluidico sono eccitati con una corrente alternata a bassa tensione a frequenze radio utilizzando un generatore di segnale. I globuli rossi in sospensione rispondono al campo elettrico e mostrano una dielettroforesi positiva (DEP), che sposta le cellule verso i bordi degli elettrodi. Le cellule vengono quindi allungate a causa delle forze elettriche esercitate sulle due metà delle cellule, con conseguente allungamento uniassiale, noto come elettrodeformazione. Il livello di sollecitazione di taglio e la deformazione risultante possono essere facilmente regolati modificando l'ampiezza dell'onda di eccitazione. Ciò consente di quantificare la deformabilità non lineare dei globuli rossi in risposta a piccole e grandi deformazioni ad alta produttività. La modifica dell'onda di eccitazione con la strategia ASK induce elettrodeformazione ciclica con velocità di carico e frequenze programmabili. Ciò fornisce un modo conveniente per la caratterizzazione della fatica dei globuli rossi. Il nostro approccio di elettrodeformazione modulato ASK consente, per la prima volta, una misurazione diretta della fatica dei globuli rossi da carichi ciclici. Può essere utilizzato come strumento per test biomeccanici generali, per analisi della deformabilità cellulare e della fatica in altri tipi di cellule e condizioni patologiche, e può anche essere combinato con strategie per controllare il microambiente delle cellule, come la tensione dell'ossigeno e segnali biologici e chimici.

Introduction

I globuli rossi (RBC) sono le cellule più deformabili nel corpo umano1. La loro deformabilità è direttamente correlata alla loro funzionalità di trasporto dell'ossigeno. È stato riscontrato che una ridotta deformabilità nei globuli rossi è correlata alla patogenesi di diversi disturbi dei globuli rossi2. Le misurazioni della deformabilità ci hanno portato a una migliore comprensione delle malattie correlate ai globuli rossi3. La durata normale dei globuli rossi può variare da 70 a 140 giorni4. Pertanto, è importante misurare come la loro deformabilità diminuisce insieme al ....

Protocol

Il sangue intero umano non identificato è stato ottenuto commercialmente. Il lavoro che coinvolge i campioni di sangue è stato eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza presso la Florida Atlantic University.

1. Preparazione del dispositivo microfluidico

  1. Fissare con nastro adesivo il wafer di silicio master SU-8 per il design del canale microfluidico all'interno di una caps.......

Representative Results

Quando la sospensione cellulare è stata caricata nel canale microfluidico, è stata osservata una distribuzione relativamente uniforme delle cellule. All'uscita del segnale (ad esempio, una semplice onda sinusoidale o una fase On-Keying di ASK) dal generatore di funzioni, gli elettrodi interdigitati a film sottile generavano un campo elettrico a corrente alternata non uniforme. Le cellule sospese hanno risposto spontaneamente a questa eccitazione elettrica e hanno mostrato un comportamento DEP positivo, cioè spostandos.......

Discussion

La modulazione ASK OOK di un'onda sinusoidale che induce forza DEP può essere utilizzata per testare la fatica meccanica dei globuli rossi per un lungo periodo di tempo. In questo protocollo, abbiamo limitato il test di fatica in vitro a 1 ora per prevenire i potenziali effetti metabolici avversi sulla deformabilità cellulare. Le condizioni complete di prova di fatica possono essere programmate utilizzando la tecnica di elettrodeformazione modulata ASK. È possibile programmare parametri come la frequenza di caricament.......

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata da NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) e NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Balance ScaleViBRAHT-224R
Bandpass filterBRIGHTLINE414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mLFisher Scientific14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mmFisher Scientific12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mmFisher Scientific12-460-4071.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gaugeBSTEANX001308N97
Bovin Serum AlbuminRMBIOBSA-BSH
CentrifugeSCILOGEX911015119999
Conical Tube, 50 mLFisher Scientific05-539-13
DextroseFisher ScientificMDX01455MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meterecoTestr358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubeswww.eppendorf.com05-402-25
ExcelMicrosoft Graph plotting
Function GeneratorSIGLENTSDG830
Glass/ITO Electrode SubstrateOSSILAS161
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
Inverted MicroscopeOLYMPUSIX81 - SN9E07015
Lab OvenQUINCY LAB (QL)MODEL 30GCEDigital Model
MatlabMathWorksGraph plotting
Micro Osmometer - Model 3300Advanced Instruments Inc.S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping FilmFisher Scientific13-374-12
Petri dishFALCONSKU=351006ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)LONZA04-479Q
Plasma CleanerHarrick plasma PDCOOLNC0301989
SolidworksDassault SystemesCAD software
SucroseFisher Scientific50-188-2419
Vacuum DesiccatorSPBEL-ARTF42400-2121
Wooden spatulaFisher ScientificNC0304136Tongue Depressors Wood NS 6"

References

  1. Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
  2. Safeukui, I., et al.

Explore More Articles

Questo mese su JoVEnumero 200

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved