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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Apresentamos aqui um protocolo para testes de fadiga mecânica no caso de hemácias humanas usando uma abordagem de eletrodeformação modulada por amplitude. Esta abordagem geral pode ser usada para medir as mudanças sistemáticas nas características morfológicas e biomecânicas de células biológicas em uma suspensão por deformação cíclica.

Abstract

As hemácias (hemácias) são conhecidas por sua notável deformabilidade. Eles sofrem repetidamente considerável deformação ao passar pela microcirculação. A deformabilidade reduzida é observada em hemácias fisiologicamente envelhecidas. As técnicas existentes para medir a deformabilidade celular não podem ser facilmente usadas para medir a fadiga, a degradação gradual nas membranas celulares causada por cargas cíclicas. Apresentamos um protocolo para avaliar a degradação mecânica em hemácias a partir de tensões cíclicas de cisalhamento usando eletrodeformação baseada em modulação de amplitude shift keying (ASK) em um canal microfluídico. Resumidamente, os eletrodos interdigitalizados no canal microfluídico são excitados com uma corrente alternada de baixa tensão em radiofrequências usando um gerador de sinais. As hemácias em suspensão respondem ao campo elétrico e exibem dieletroforese positiva (DEP), que move as células para as bordas do eletrodo. As células são então esticadas devido às forças elétricas exercidas sobre as duas metades celulares, resultando em estiramento uniaxial, conhecido como eletrodeformação. O nível de tensão de cisalhamento e a deformação resultante podem ser facilmente ajustados alterando a amplitude da onda de excitação. Isso permite quantificações da deformabilidade não linear das hemácias em resposta a pequenas e grandes deformações em alto rendimento. A modificação da onda de excitação com a estratégia ASK induz eletrodeformação cíclica com taxas de carregamento e frequências programáveis. Isso fornece uma maneira conveniente para a caracterização da fadiga eritrocitária. Nossa abordagem de eletrodeformação modulada por ASK permite, pela primeira vez, uma medição direta da fadiga das hemácias a partir de cargas cíclicas. Ele pode ser usado como uma ferramenta para testes biomecânicos gerais, para análises de deformabilidade e fadiga celular em outros tipos celulares e condições doentes, e também pode ser combinado com estratégias para controlar o microambiente das células, como tensão de oxigênio e pistas biológicas e químicas.

Introduction

As hemácias (hemácias) são as células mais deformáveis do corpo humano1. Sua deformabilidade está diretamente relacionada à sua funcionalidade de transporte de oxigênio. Descobriu-se que a deformabilidade reduzida nas hemácias se correlaciona com a patogênese de várias doenças eritrocitárias2. Medidas de deformabilidade nos levaram a um melhor entendimento das doenças relacionadas às hemácias3. A vida normal das hemácias pode variar de 70 a 140 dias4. Portanto, é importante medir como sua deformabilidade diminui com o processo de envelhecimento, por exemplo, seu comportamen....

Protocol

Sangue total humano desidentificado foi obtido comercialmente. O trabalho envolvendo as amostras de sangue foi realizado em um laboratório de nível 2 de biossegurança, utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Florida Atlantic University.

1. Preparação do dispositivo microfluídico

  1. Tape o wafer de silício mestre SU-8 para o design do canal microfluídico no interior de uma placa de Petri de plástico de 14 cm e limpe-o com .......

Representative Results

Quando a suspensão celular foi carregada no canal microfluídico, uma distribuição relativamente uniforme das células foi observada. Após a saída do sinal (por exemplo, uma onda senoidal simples ou fase On-Keying do ASK) do gerador de função, os eletrodos interdigitados de filme fino geraram um campo elétrico de corrente alternada não uniforme. As células em suspensão responderam espontaneamente a essa excitação elétrica e exibiram um comportamento DEP positivo, ou seja, movendo-se em direção às bordas .......

Discussion

A modulação ASK OOK de uma onda senoidal indutora de força DEP pode ser usada para testar a fadiga mecânica de hemácias por um longo período de tempo. Neste protocolo, limitamos o teste de fadiga in vitro a 1 hora para prevenir os potenciais efeitos metabólicos adversos sobre a deformabilidade celular. Condições abrangentes de teste de fadiga podem ser programadas usando a técnica de eletrodeformação modulada por ASK. Parâmetros como frequência de carregamento, amplitude e taxa de carregamento podem ser pro.......

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pela NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) e NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Balance ScaleViBRAHT-224R
Bandpass filterBRIGHTLINE414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mLFisher Scientific14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mmFisher Scientific12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mmFisher Scientific12-460-4071.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gaugeBSTEANX001308N97
Bovin Serum AlbuminRMBIOBSA-BSH
CentrifugeSCILOGEX911015119999
Conical Tube, 50 mLFisher Scientific05-539-13
DextroseFisher ScientificMDX01455MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meterecoTestr358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubeswww.eppendorf.com05-402-25
ExcelMicrosoft Graph plotting
Function GeneratorSIGLENTSDG830
Glass/ITO Electrode SubstrateOSSILAS161
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
Inverted MicroscopeOLYMPUSIX81 - SN9E07015
Lab OvenQUINCY LAB (QL)MODEL 30GCEDigital Model
MatlabMathWorksGraph plotting
Micro Osmometer - Model 3300Advanced Instruments Inc.S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping FilmFisher Scientific13-374-12
Petri dishFALCONSKU=351006ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)LONZA04-479Q
Plasma CleanerHarrick plasma PDCOOLNC0301989
SolidworksDassault SystemesCAD software
SucroseFisher Scientific50-188-2419
Vacuum DesiccatorSPBEL-ARTF42400-2121
Wooden spatulaFisher ScientificNC0304136Tongue Depressors Wood NS 6"

References

  1. Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
  2. Safeukui, I., et al.

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