Eletrodeformação modulada em amplitude para avaliação da fadiga mecânica de células biológicas

Summary

Apresentamos aqui um protocolo para testes de fadiga mecânica no caso de hemácias humanas usando uma abordagem de eletrodeformação modulada por amplitude. Esta abordagem geral pode ser usada para medir as mudanças sistemáticas nas características morfológicas e biomecânicas de células biológicas em uma suspensão por deformação cíclica.

Abstract

As hemácias (hemácias) são conhecidas por sua notável deformabilidade. Eles sofrem repetidamente considerável deformação ao passar pela microcirculação. A deformabilidade reduzida é observada em hemácias fisiologicamente envelhecidas. As técnicas existentes para medir a deformabilidade celular não podem ser facilmente usadas para medir a fadiga, a degradação gradual nas membranas celulares causada por cargas cíclicas. Apresentamos um protocolo para avaliar a degradação mecânica em hemácias a partir de tensões cíclicas de cisalhamento usando eletrodeformação baseada em modulação de amplitude shift keying (ASK) em um canal microfluídico. Resumidamente, os eletrodos interdigitalizados no canal microfluídico são excitados com uma corrente alternada de baixa tensão em radiofrequências usando um gerador de sinais. As hemácias em suspensão respondem ao campo elétrico e exibem dieletroforese positiva (DEP), que move as células para as bordas do eletrodo. As células são então esticadas devido às forças elétricas exercidas sobre as duas metades celulares, resultando em estiramento uniaxial, conhecido como eletrodeformação. O nível de tensão de cisalhamento e a deformação resultante podem ser facilmente ajustados alterando a amplitude da onda de excitação. Isso permite quantificações da deformabilidade não linear das hemácias em resposta a pequenas e grandes deformações em alto rendimento. A modificação da onda de excitação com a estratégia ASK induz eletrodeformação cíclica com taxas de carregamento e frequências programáveis. Isso fornece uma maneira conveniente para a caracterização da fadiga eritrocitária. Nossa abordagem de eletrodeformação modulada por ASK permite, pela primeira vez, uma medição direta da fadiga das hemácias a partir de cargas cíclicas. Ele pode ser usado como uma ferramenta para testes biomecânicos gerais, para análises de deformabilidade e fadiga celular em outros tipos celulares e condições doentes, e também pode ser combinado com estratégias para controlar o microambiente das células, como tensão de oxigênio e pistas biológicas e químicas.

Introduction

As hemácias (hemácias) são as células mais deformáveis do corpo humano¹. Sua deformabilidade está diretamente relacionada à sua funcionalidade de transporte de oxigênio. Descobriu-se que a deformabilidade reduzida nas hemácias se correlaciona com a patogênese de várias doenças eritrocitárias². Medidas de deformabilidade nos levaram a um melhor entendimento das doenças relacionadas às hemácias3. A vida normal das hemácias pode variar de 70 a 140 dias⁴. Portanto, é importante medir como sua deformabilidade diminui com o processo de envelhecimento, por exemplo, seu comportamen....

Protocol

Sangue total humano desidentificado foi obtido comercialmente. O trabalho envolvendo as amostras de sangue foi realizado em um laboratório de nível 2 de biossegurança, utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Florida Atlantic University.

1. Preparação do dispositivo microfluídico

1. Tape o wafer de silício mestre SU-8 para o design do canal microfluídico no interior de uma placa de Petri de plástico de 14 cm e limpe-o com .......

Discussion

A modulação ASK OOK de uma onda senoidal indutora de força DEP pode ser usada para testar a fadiga mecânica de hemácias por um longo período de tempo. Neste protocolo, limitamos o teste de fadiga in vitro a 1 hora para prevenir os potenciais efeitos metabólicos adversos sobre a deformabilidade celular. Condições abrangentes de teste de fadiga podem ser programadas usando a técnica de eletrodeformação modulada por ASK. Parâmetros como frequência de carregamento, amplitude e taxa de carregamento podem ser pro.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"