Detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa

Summary

Pseudomonas aeruginosa produz os biossurfactantes ramnolipídicos. A cromatografia em camada delgada detecta e determina a proporção de mono e di-ramnolipídios produzidos por cada cepa. A quantificação de ramnolipídios totais envolve a avaliação dos equivalentes de ramnose presentes nesses biossurfactantes extraídos dos sobrenadantes de cultura usando o método do orcinol.

Abstract

A bactéria ambiental Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista com alta resistência a antibióticos que representa um risco à saúde. Essa bactéria produz altos níveis de biossurfactantes conhecidos como ramnolipídios (RL), que são moléculas com valor biotecnológico significativo, mas também estão associadas a características de virulência. A este respeito, a detecção e quantificação de RL podem ser úteis tanto para aplicações biotecnológicas quanto para projetos de pesquisa biomédica. Neste artigo, demonstramos passo a passo a técnica para detectar a produção das duas formas de RL produzidas por P. aeruginosa usando cromatografia em camada delgada (TLC): mono-ramnolipídios (mRL), moléculas constituídas por um dímero de ácidos graxos (principalmente C10-C10) ligado a uma porção ramnose, e di-ramnolipídios (dRL), moléculas constituídas por um dímero de ácido graxo semelhante ligado a duas frações ramnose. Além disso, apresentamos um método para medir a quantidade total de RL com base na hidrólise ácida desses biossurfactantes extraídos de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa e a subsequente detecção da concentração de ramnose que reage com o orcinol. A combinação de ambas as técnicas pode ser usada para estimar a concentração aproximada de mRL e dRL produzida por uma cepa específica, como exemplificado aqui com as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria ambiental e um patógeno oportunista de grande preocupação devido à sua produção de características associadas à virulência e sua alta resistência a antibióticos ^1,2. Um metabólito secundário característico produzido por essa bactéria é o biossurfactante RL, que é produzido de forma coordenada com várias características associadas à virulência, como a fenazina piocianina, um antibiótico com atividade redox, e a protease elastase³. As propriedades tensioativas e emulsificantes do RL têm sido exploradas em diferentes apli....

Protocol

Este procedimento está esquematizado na Figura Suplementar 1. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Detecção de mRL e dRL em sobrenadantes de cultura de P. aeruginosa usando TLC

1. Comece com o caldo centrifugado da cepa de interesse de P. aeruginosa , cultivada em meio líquido por 24 h (para atingir a fase estacionária de .......

Discussion

O método mais preciso para detectar e quantificar o RL é a HPLC acoplada à espectrometria de massa (MS)^7,8,27; no entanto, requer equipamentos especializados e caros que podem não ser acessíveis a muitos pesquisadores. Os métodos aqui descritos podem ser realizados rotineiramente com materiais e equipamentos básicos de laboratório para detectar e estimar as concentrações de RL, mas apresentam algumas limitações, part.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C