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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Pseudomonas aeruginosa produz os biossurfactantes ramnolipídicos. A cromatografia em camada delgada detecta e determina a proporção de mono e di-ramnolipídios produzidos por cada cepa. A quantificação de ramnolipídios totais envolve a avaliação dos equivalentes de ramnose presentes nesses biossurfactantes extraídos dos sobrenadantes de cultura usando o método do orcinol.

Abstract

A bactéria ambiental Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista com alta resistência a antibióticos que representa um risco à saúde. Essa bactéria produz altos níveis de biossurfactantes conhecidos como ramnolipídios (RL), que são moléculas com valor biotecnológico significativo, mas também estão associadas a características de virulência. A este respeito, a detecção e quantificação de RL podem ser úteis tanto para aplicações biotecnológicas quanto para projetos de pesquisa biomédica. Neste artigo, demonstramos passo a passo a técnica para detectar a produção das duas formas de RL produzidas por P. aeruginosa usando cromatografia em camada delgada (TLC): mono-ramnolipídios (mRL), moléculas constituídas por um dímero de ácidos graxos (principalmente C10-C10) ligado a uma porção ramnose, e di-ramnolipídios (dRL), moléculas constituídas por um dímero de ácido graxo semelhante ligado a duas frações ramnose. Além disso, apresentamos um método para medir a quantidade total de RL com base na hidrólise ácida desses biossurfactantes extraídos de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa e a subsequente detecção da concentração de ramnose que reage com o orcinol. A combinação de ambas as técnicas pode ser usada para estimar a concentração aproximada de mRL e dRL produzida por uma cepa específica, como exemplificado aqui com as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria ambiental e um patógeno oportunista de grande preocupação devido à sua produção de características associadas à virulência e sua alta resistência a antibióticos 1,2. Um metabólito secundário característico produzido por essa bactéria é o biossurfactante RL, que é produzido de forma coordenada com várias características associadas à virulência, como a fenazina piocianina, um antibiótico com atividade redox, e a protease elastase3. As propriedades tensioativas e emulsificantes do RL têm sido exploradas em diferentes apli....

Protocol

Este procedimento está esquematizado na Figura Suplementar 1. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Detecção de mRL e dRL em sobrenadantes de cultura de P. aeruginosa usando TLC

  1. Comece com o caldo centrifugado da cepa de interesse de P. aeruginosa , cultivada em meio líquido por 24 h (para atingir a fase estacionária de .......

Representative Results

Neste artigo, três cepas diferentes do tipo P. aeruginosa foram utilizadas para representar três filogrupos, cada um com diferentes níveis de produção de RL e proporções de mRL e dRL. Essas cepas incluem PAO1 (um isolado de ferida da Austrália, 195522), PA14 (um isolado de planta dos EUA, 197723) e PA7 (um isolado clínico da Argentina, 201024). Como controle negativo, foi empregado o mutante PAO1 rhlA, que é incapaz de produzir RL........

Discussion

O método mais preciso para detectar e quantificar o RL é a HPLC acoplada à espectrometria de massa (MS)7,8,27; no entanto, requer equipamentos especializados e caros que podem não ser acessíveis a muitos pesquisadores. Os métodos aqui descritos podem ser realizados rotineiramente com materiais e equipamentos básicos de laboratório para detectar e estimar as concentrações de RL, mas apresentam algumas limitações, part.......

Acknowledgements

O laboratório do GSCh é apoiado em parte por IN201222 de bolsas do Programa de Apoio a Projetos de Investigação e Inovação Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-NAPHTHOLSIGMA-ALDRICH70442
ACETIC ACIDJ.T. BAKER9508-02
CENTRIFUGEFor centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORMJ.T. BAKER9180-02
DRYING OVEN
ETHERJ.T. BAKER9244-02
GLASS PIPETTESIGMA-ALDRICHCLS706510
HYDROCHLORIC ACIDJ.T. BAKER5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATESIGMA-ALDRICHR-3875
METHANOLJ.T. BAKER9049-02
ORCINOL MONOHYDRATESIGMA-ALDRICHO1875
PPGAS BrothTris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)SIGMA-ALDRICHZ276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANKFISHER SCIENTIFICK4161801020
RHAMNOLIPIDS SIGMA-ALDRICHR-90
SPECTROPHOTOMETERVIS
SPRAYERSIGMA-ALDRICHZ529710-1EA
SULFURIC ACIDJ.T. BAKER9681-02
TES TUBES 5mLCORNING352002
TLC SILICA GEL 60 F254MERCK1.05554.0001
WATER BATH> 80 °C

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
  2. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W.

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Palavras chave Pseudomonas AeruginosaRamnolip diosMono ramnolip diosDi ramnolip diosCromatografia em Camada DelgadaEnsaio de OrcinolBiossurfactantesVirul nciaResist ncia a Antibi ticosBiotecnologia

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