רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מבנה פיזיולוגי דינמי המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, אסטרוציטים ופריציטים. על-ידי תיאום האינטראקציה בין מעבר מוגבל של חומרים מזיקים, ספיגת חומרים מזינים וסילוק מטבוליטים במוח, מחסום הדם-מוח חיוני לשימור הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. בניית מודלים חוץ גופיים של BBB היא כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירולוגיות ויצירת טיפולים תרופתיים. מחקר זה מתאר הליך ליצירת מודל תאי BBB חד-שכבתי במבחנה על ידי זריעת תאי bend.3 לתוך החדר העליון של צלחת בעלת 24 בארות. כדי להעריך את שלמות תפקוד מחסום התא, נעשה שימוש במד מתח תאי אפיתל קונבנציונלי כדי לרשום את ההתנגדות החשמלית הטרנסממברנה של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים המושרים על ידי CoCl₂ בזמן אמת. אנו צופים כי הניסויים הנ"ל יספקו רעיונות יעילים ליצירת מודלים חוץ גופיים של BBB ותרופות לטיפול בהפרעות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

BBB הוא ממשק ביולוגי ייחודי בין מחזור הדם לרקמת העצב, המורכב מתאי אנדותל וסקולריים, פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים ומבנים תאיים אחרים¹. זרימת היונים, הכימיקלים והתאים בין הדם למוח מווסתת בקפדנות על ידי מחסום זה. הומאוסטזיס זה מגן על רקמות העצבים מפני רעלים ופתוגנים תוך שהוא מאפשר פעולה מתאימה של עצבי המוח ^2,3. שמירה על שלמות BBB יכולה למנוע ביעילות התפתחות והתקדמות של הפרעות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כגון תפקוד עצבי, בצקת ודלקת עצבית⁴. עם זאת, התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של BBB מונעות מיותר מ-98% מהתרופות במולקולות קטנות ומ-100% מהתרופות המקרומולקולארי....

Protocol

הערה: תאי אנדותל שמקורם במוח עכבר.3 (bBend.3) חוסנו לתוך תאים של צלחת בת 24 בארות כדי לבנות מודל פשוט במבחנה של BBB בתנאים בינוניים ספציפיים. ה-TEER של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים נמדד על-ידי מד TEER (איור 1 ואיור 2).

1. הכנת פתרון

1. הכינו .......

Discussion

אחד מאיברי הגוף המפותחים ביותר, המוח שולט במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים, כולל זיכרון, קוגניציה, שמיעה, ריח ותנועה²⁷. המוח הוא אחד האיברים המסובכים והמטופלים ביותר בגוף האדם בעת ובעונה אחת. הופעתן של הפרעות רבות במערכת העצבים המרכזית מראה נטייה גוברת משנה לשנה בשל ג?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well transwell plate	Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm)	10522023
75 % ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
96-well plate	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd	220412-078-B
bEnd.3 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8)	Boster Biological Technology Co., Ltd	BG0025
Cell culture dish (100mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cobalt Chloride (CoCl2)	Sigma	15862
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8121587
Fetal bovine serum	Gibco ThermoFisher Scientific	2166090RP
GraphPad Prism software	GraphPad Software	9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV)	MedChemexpress	HY-K6002
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x)	Gibco ThermoFisher Scientific	8120485
Sodium hypochlorite	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2022091501
Transmembrane resistance meter	World Precision Instruments LLC	VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045