Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

Summary

Aqui, apresentamos um sistema modelo assemblóide para mimetizar o crosstalk celular do tendão entre o tecido central do tendão que suporta carga e um compartimento extrínseco contendo populações celulares ativadas por doença e lesão. Como um importante caso de uso, demonstramos como o sistema pode ser implantado para sondar a ativação de células endoteliais extrínsecas relevantes para a doença.

Abstract

Os tendões permitem a locomoção transferindo forças musculares para os ossos. Eles dependem de um núcleo tendíneo resistente composto por fibras colágenas e populações de células estromais. Esse núcleo de suporte de carga é englobado, nutrido e reparado por uma camada de tecido semelhante a um sinovial que compreende o compartimento extrínseco do tendão. Apesar desse design sofisticado, lesões tendíneas são comuns, e o tratamento clínico ainda depende de fisioterapia e cirurgia. As limitações dos sistemas de modelos experimentais disponíveis retardaram o desenvolvimento de novos tratamentos modificadores da doença e regimes clínicos de prevenção de recaída.

Os estudos in vivo em humanos limitam-se a comparar tendões saudáveis com tecidos doentes ou rotos em estágio terminal amostrados durante a cirurgia de reparo e não permitem o estudo longitudinal da doença tendínea subjacente. Modelos animais in vivo também apresentam limites importantes em relação à complexidade fisiológica opaca, à carga ética sobre os animais e aos grandes custos econômicos associados ao seu uso. Além disso, modelos animais in vivo são pouco adequados para sondagem sistemática de drogas e vias de interação multicelular e multitecidual. Sistemas modelos in vitro mais simples também ficaram aquém. Uma das principais razões é a falha em replicar adequadamente a carga mecânica tridimensional necessária para estudar significativamente as células tendinosas e sua função.

O novo sistema de modelo 3D apresentado aqui alivia alguns desses problemas explorando explantes de núcleo do tendão da cauda murina. É importante ressaltar que esses explantes são facilmente acessíveis em grande número a partir de um único mouse, retêm padrões de carregamento 3D in situ no nível celular e apresentam uma matriz extracelular semelhante à in vivo. Neste protocolo, instruções passo a passo são dadas sobre como aumentar os explantes do núcleo do tendão com hidrogéis de colágeno carregados de células endoteliais derivadas do músculo, fibroblastos derivados do tendão e macrófagos derivados da medula óssea para substituir as populações de células ativadas por doenças e lesões dentro do compartimento extrínseco do tendão. Demonstra-se como os assembloides tendinosos resultantes podem ser desafiados mecanicamente ou através de estímulos microambientais definidos para investigar crosstalk multicelular emergente durante doença e lesão.

Introduction

Em sua função de transferir forças musculares para os ossos para permitir o movimento, os tendões enfrentam alguns dos mais extremos estresses mecânicos que ocorrem no corpo humano ^1,2,3. Devido ao envelhecimento das sociedades, ao aumento da prevalência da obesidade e à crescente popularidade de atividades esportivas mecanicamente exigentes, projeta-se que a prevalência de doenças e lesões tendíneas aumente nos países^{desenvolvidos4,5,6}. O desenvolvimento de novos esquemas de tratamento baseados em evidências e modificadores da doença para combater esse aumento tem sido dificultado pelas limitações dos sistemas-modelo atualmente disponíveis ^1,7,8.

Idealmente, os modelos de reparo de doenças e lesões permitiriam estudar como o órgão-alvo processa um conjunto definido de parâmetros de entrada (imitando gatilhos de doença, Tabela 1) em parâmetros de saída mensuráveis (representando as características da doença, Tabela 2), controlando os fatores de confusão. Estudos utilizando tais sistemas modelo seriam então capazes de identificar os processos (pato-) fisiológicos subjacentes ao reparo de doenças e lesões e obter conhecimentos que poderiam ser explorados para prevenir ou reduzir as características de doenças e lesões nas clínicas. Aplicando esse princípio aos tendões, um sistema modelo útil deve recapitular partes centrais da resposta in vivo do tendão à doença e à lesão, que englobam as seguintes características: microdano, inflamação, neovascularização, hipercelularidade, turnover acelerado da matriz e descompartimentalização9,10,11,12,13,14,15. Usando essas características como base, os seguintes requisitos para um sistema modelo de reparo de lesões e doenças tendíneas bem-sucedido podem ser inferidos.

Hipotetiza-se que a sobrecarga mecânica seja um fator central na patogênese da lesão tendínea e da doença, sendo, portanto, uma abordagem experimental comumente usada para criar^microdanos16. A capacidade de carga mecânica controlável é, portanto, um pré-requisito primordial para modelos de reparo de doenças e lesões tendíneas. Idealmente, o sistema do modelo permite três modos principais: carga única de estiramento a dano, carga em fadiga e descarga ^8,17,18. Na deformação mecânica, as células residentes no tecido experimentam uma combinação complexa de forças tensionais, forças de cisalhamento (devido ao deslizamento das fibras colágenas ao redor das células) e forças de compressão que ocorrem durante a descarga ou próximo à entese^19,20. Os sistemas modelo devem recriar esses padrões de carregamento complexos o mais próximo possível.

Uma maneira alternativa de introduzir microdanos na matriz é aproveitar estressores bioquímicos que mimetizam predisposições sistêmicas para doenças e lesões tendíneas, como citocinas (pró-)inflamatórias, estresse oxidativo ou altas concentrações de glicose 21,22,23. Consequentemente, um microambiente de nicho controlável é vantajoso para um sistema modelo de reparo de doenças e lesões tendíneas.

Um pré-requisito comum para que sistemas-modelo sejam capazes de recapitular inflamação, neovascularização e hipercelularidade é a presença seletiva de populações celulares que conduzem esses processos²⁴. Para processos inflamatórios, essas populações incluem neutrófilos, células T e macrófagos, enquanto células endoteliais e pericitos seriam necessários para estudar a neovascularização 25,26,27,28,29. Os fibroblastos tendíneos não são apenas vitais para o reparo tendíneo, mas, como células proliferativas e migratórias, também parcialmente responsáveis pela hipercelularidade local observada na doença tendínea30,31,32,33,34,35,36.

Além das alterações nas populações celulares residentes, a composição da matriz tendínea encontra-se alterada nas doenças e lesões tendíneas7,37,38,39,40. Para apresentar as pistas microambientais relevantes para a doença, os sistemas-modelo devem ser capazes de integrar uma composição de matriz extracelular compatível com o estágio alvo da doença ou lesão, por exemplo, permitindo combinações proporcionais relevantes de colágeno-1, colágeno-3 e fibronectina celular⁴¹.

A compartimentalização de tendões sadios no núcleo do tendão e nos compartimentos extrínsecos (isto é, endotenon, epitenon e paratenon) é central para sua função e frequentemente perturbada em tendões doentes ou lesados 1,42,43,44,45,46,47 . A incorporação da compartimentalização 3D do tendão em sistemas modelo de tendão é, portanto, necessária não apenas para simular mais de perto os processos subjacentes à descompartimentação e recompartimentação, mas também ajuda a estabelecer os gradientes espaço-temporais corretos de citocinas e nutrientes^48,49.

Finalmente, a modularidade é outro ativo central dos sistemas modelo, permitindo aos pesquisadores combinar a correta contribuição relativa e interação entre os estressores descritos anteriormente durante os processos investigados ^8,17.

Além de selecionar as modalidades de entrada ideais, um passo importante é ser capaz de medir, observar e rastrear mudanças na saída resultante. As propriedades mecânicas do sistema modelo (i.e., comprimento da região dos dedos, módulo elástico linear, deformação máxima à tração, tensão máxima de tração, resistência à fadiga e relaxamento de tensões) são centrais aqui, pois caracterizam a função principal do tendão 50,51,52. Para relacionar essas alterações funcionais às alterações no nível tecidual, é importante permitir métodos que detectem danos à matriz estrutural (colágeno) e rastreiem a proliferação e o recrutamento de populações celulares relevantes para doenças e reparos 30,53,54,55,56,57,58,59,60.

Para estudar o crosstalk célula-célula e célula-matriz emergente, deve-se ser capaz de isolar ou marcar proteínas em quantidades adequadas para quantificação (i.e., ELISA, proteômica, imunohistoquímica, citometria de fluxo)14,21,61,62. A análise da expressão gênica populacional ou, pelo menos, compartimento-específica também deve ser possível (i.e., classificação celular ativada por fluorescência [FACS], sequenciamento de RNA de célula única/RNA em massa e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR))21,24,27,63. O sistema modelo deve permitir a medição do maior número de parâmetros de saída acima mencionados no mesmo espécime e em vários corpos de prova de uma maneira rápida o suficiente para desbloquear estudos de alto rendimento.

Entre os sistemas-modelo atualmente disponíveis para estudar a reparação de doenças e lesões tendíneas humanas, o próprio corpo humano é, naturalmente, o mais representativo. É também o menos compatível com a intervenção experimental. Enquanto pacientes com lesões agudas do tendão estão abundantemente disponíveis para estudos clínicos, pacientes com tendinopatia precoce (a doença tendínea mais comum) são em grande parte livres de sintomas e muitas vezes não são detectados clinicamente até que alterações mais graves se manifestem14,64,65. Isso torna difícil identificar o momento crítico em que a homeostase tendínea descarrila e os mecanismos por trás desse descarrilamento 16,66,67,68,69. Além disso, a extração de biópsias de tendões saudáveis é eticamente desafiadora, pois pode resultar em danos persistentes. Remanescentes de tendões isquiotibiais da cirurgia de reconstrução do ligamento cruzado anterior são frequentemente usados como controles saudáveis, mas indiscutivelmente diferem em função, propriedades mecânicas, populações celulares e composição da matriz em comparação com os tendões do manguito rotador, Aquiles e patelar, comumente afetados por doença e lesão tendínea 70,71,72,73.

Os modelos animais in vivo são mais acessíveis e tratáveis, mas seu uso impõe uma carga ética significativa aos animais e um custo econômico aos pesquisadores. Além disso, a maioria dos animais modelo populares não desenvolve lesões tendinopáticas espontaneamente (isto é, ratos, camundongos, coelhos) ou não possui os primers e cepas geneticamente modificadas necessárias para rastrear as vias de comunicação multicelular envolvidas (isto é, cavalos, coelhos).

Sistemas modelo 2D in vitro simples estão do outro lado do espectro de complexidade/tratabilidade e permitem melhor o estudo controlado e eficiente em termos de tempo de vias específicas de comunicação intercelular em resposta a um conjunto mais controlável de gatilhos ^8,74. No entanto, esses sistemas simplificados geralmente falham em recapitular o carregamento mecânico multidimensional (isto é, tensão, compressão e cisalhamento) que é central para a funcionalidade do tendão. Além disso, as (também) altas rigidezes do plástico de cultura de tecidos tendem a se sobrepor a quaisquer pistas matriciais fornecidas por revestimentos destinados a mimetizar o estado de interesse da doença^75,76.

Para superar essa desvantagem, sistemas de modelos 3D cada vez mais sofisticados têm sido desenvolvidos para fornecer uma matriz carregável cuja composição possa ser pelo menos parcialmente compatível com o estado desejado da doença 77,78,79. Ainda assim, esses sistemas não apenas lutam para replicar com precisão as complexas composições de matriz extracelular in vivo e padrões de carga celular, mas geralmente carecem de capacidade de carga a longo prazo e das interfaces compartimentais necessárias para estudar as vias de comunicação intercompartimentais que coordenam o reparo de doenças e lesões tendíneas 48,49,80.

Sistemas modelo de explante de tendão ex vivo têm a vantagem distinta de uma composição de matriz embutida in vivo, que compreende nichos pericelulares, barreiras transcompartimentais, bem como gradientes espaço-temporais de citocinas/nutrientes e recapitula padrões complexos de carga quando esticados⁸. Como resultado dos limites de difusão de nutrientes dependentes do tamanho, explantes de modelos animais maiores (i.e., cavalos) são difíceis de manter vivos para o estudo a longo prazo de doenças tendíneas e reparo de lesões 81,82,83. Enquanto isso, explantes menores de espécies murinas (i.e., tendão de Aquiles, tendão patelar) são difíceis de fixar e carregar mecanicamente de forma reprodutível. Seu tamanho também restringe a quantidade de material que pode ser coletado para leituras em nível de célula, proteína e gene sem reunir amostras e diminuir o rendimento. Nesse sentido, os fascículos tendinosos da cauda murina oferecem o potencial para desbloquear o estudo de alto rendimento do reparo de doenças e lesões tendíneas, uma vez que estão prontamente disponíveis em grandes quantidades a partir de um único camundongo, preservam a complexa composição da matriz pericelular in vivo e recapitulam os padrões de carga celular. Durante o processo de extração, entretanto, perdem a maior parte de seu compartimento extrínseco e nele continham populações vasculares, imunológicas e de fibroblastos, que hoje são consideradas como condutoras de doenças tendíneas e reparo ^8,18.

Para preencher essa lacuna, um sistema modelo combinando as vantagens dos explantes de núcleo derivados do tendão da cauda murina com as vantagens dos sistemas modelo baseados em hidrogel 3D foi desenvolvido. Esse sistema modelo consiste de um hidrogel carregado de células (colágeno-1) lançado ao redor de explantes tendinosos da^cauda84,85. Neste artigo, as etapas de fabricação necessárias são fornecidas em detalhes, juntamente com leituras úteis que podem ser obtidas pela co-cultura de explantes de núcleo (compartimento intrínseco) dentro de um hidrogel de colágeno tipo 1 carregado de células endoteliais (compartimento extrínseco).

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelas autoridades responsáveis (números de licença do Cantão de Zurique ZH104-18 e ZH058-21). Uma visão geral é apresentada na Figura 1.

1. Isolamento de componentes do tendão assemblóide de camundongos com 12-15 semanas de idade (i.e., B6/J-Rj)

1. Eutanásia dos camundongos por asfixia induzida por gás CO₂ . Para maximizar o rendimento, não processe mais de 3 ratos de cada vez e proceda ao isolamento celular imediatamente após a eutanásia.
2. Garantir a morte por indução bilateral de pneumotórax.
3. Esterilize a pele do rato com etanol a 80% e mova o rato para uma capa de biossegurança estéril.
4. Isolar explantes do núcleo do tendão da cauda.
   1. Use um bisturi (nº 21) para separar a cauda do rato, cortando-a em sua base.
   2. Começando pela ponta da cauda, segure-a com a pinça e mexa-a para quebrar a pele. Em seguida, puxe suavemente a pinça para longe da cauda para expor os explantes do núcleo do tendão.
   3. Coloque os explantes do núcleo do tendão no meio de cultura padrão (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina + 1% aminoácidos não essenciais) e separe-os da parte da cauda arrancada usando uma lâmina de bisturi fresca (nº 21).
   4. Repita as etapas 1.4.2. e 1.4.3. até que toda a cauda seja processada e os explantes tendinosos se tornem menores que 25 mm.
   5. Cortar os explantes isolados do núcleo em pedaços de 25 mm de comprimento utilizando uma lâmina de bisturi fresca (nº 21).
   6. Meça o diâmetro médio dos explantes do núcleo com um microscópio de luz conectado a um software de análise de imagem através de uma câmera digital acoplável em C.
      1. Use apontar e clicar para selecionar a ferramenta de medição de linha no lado direito.
      2. Meça o diâmetro do explante em três locais diferentes e calcule seu diâmetro médio.
      3. Para facilitar o clampeamento e os ensaios mecânicos posteriores, proceder apenas com explantes de núcleo com diâmetro médio superior a 100 μm.
   7. A descarga combinada com a exposição às condições padrão de cultura (37 °C, 20% O₂, suplementação sérica) altera a expressão gênica dentro de 6 h após o isolamento e resulta em degradação dentro de 7 dias²¹. Para começar com um estado quase homeostático, produza os assembloides tendinosos e inicie os experimentos imediatamente após o isolamento do núcleo do tendão.
   8. Dependendo do arranjo experimental, explantes desvitalizados do tendão central são necessários como grupo controle. Para desvitalizar os explantes do núcleo do tendão, congele-os em um pequeno recipiente cheio de nitrogênio líquido por 5 s usando uma pinça e, em seguida, descongele-os por 5 s à temperatura ambiente (TR). Repita este ciclo de congelamento-descongelamento 3 vezes e prossiga com o passo 4 ("Apertando os explantes do núcleo").
      CUIDADO: O nitrogênio líquido pode causar queimaduras a frio, asfixia e fragiliza muitos materiais comuns. Use apenas recipientes projetados para líquidos de baixa temperatura e use roupas de proteção (por exemplo, protetor facial, luvas apropriadas, sapatos de tampo fechado).
5. Isolar fibroblastos tendíneos.
   1. Use um bisturi (nº 21) para fazer uma incisão transversal no meio do pé do rato. Faça dois cortes perpendiculares ao pé ao longo das laterais das patas traseiras e até os quadris de cada extremidade desta incisão.
   2. Use a pinça para fixar o retalho cutâneo no pé e descascar a pele que cobre os músculos da panturrilha. Ao isolar as células endoteliais do mesmo camundongo, remova toda a pele.
   3. Separe o tendão de Aquiles do osso calcâneo com uma lâmina de bisturi fresca (nº 21). Fixe a extremidade solta do tendão de Aquiles com a pinça e separe a outra extremidade do músculo gastrocnêmio.
   4. Lave o tendão de Aquiles uma vez em PBS e use o bisturi (nº 21) para remover todo o tecido muscular restante até que reste apenas o tecido do tendão branco. Se as células endoteliais forem isoladas do mesmo rato, deixe o tendão de Aquiles em PBS e continue com o passo 1.6. primeiro.
   5. Agrupar os tendões de Aquiles de um animal em um tubo plástico de 15 mL contendo 10 mL de meio de digestão do tendão (DMEM/F12 + penicilina a 1%/estreptomicina + anfotericina a 1% + 2 mg/mL de colagenase 1) e digerir por 6-8 h a 37 °C sob agitação lenta e constante usando um agitador orbital de baixa velocidade a 15 rpm.
   6. Centrifugar a solução digerida do tendão a 500 x g por 5 min no TR, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 8 mL de meio de cultura padrão (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina + 1% aminoácidos não essenciais) e cultura em frasco de cultura T25 em condições padrão de cultura (37 °C, 20% O₂) por 7 dias sem troca de meio. Depois disso, troque a mídia uma vez por semana.
   7. Dividir as células com 80% de confluência em frasco de cultura T150 (1:6). Congelar as células na passagem 2 em 2 mL de meio de congelamento filtrado estéril (70% DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO) distribuídos em dois criotubos de 1,5 mL e mantê-los a -80 °C até novo uso. Use tripsina para remover as células do plástico de cultura de tecidos.
6. Isolar células endoteliais derivadas do músculo.
   1. Se os fibroblastos tendinosos não forem isolados do mesmo rato, comece pelos passos 1.5.1 e 1.5.2.
   2. Use uma tesoura para separar as patas traseiras do corpo, cortando a articulação do quadril.
   3. Lave as patas traseiras uma vez em PBS frio (~ 4 °C), remova os músculos (quadríceps femoral, extensor longo dos dedos, sóleo e gastrocnêmio) com um bisturi (nº 21) e coloque os músculos em uma placa de Petri no gelo.
   4. Use uma lâmina de bisturi fresca (No. 21) para picar o tecido muscular em pedaços menores que 1 mm³ , mantendo a placa de Petri no gelo.
   5. Agrupar o tecido muscular picado de ambas as patas traseiras em um tubo plástico de 50 mL contendo 12,5 mL de meio de digestão muscular (PBS + 2 mg/mL de colagenase IV + 2 mg/mL dispase II + 2 mM de CaCl₂).
   6. Coloque o tubo de plástico num banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. Agite vigorosamente a solução e coloque-a de volta por mais 10 min. Repita até que a solução pareça ser homogênea e restem apenas pedaços (brancos) de tendão e fáscia (ca. 4 x 10 min). Enquanto isso, continuar com o isolamento de fibroblastos tendíneos ou o isolamento de macrófagos.
   7. Adicione 12,5 mL de PBS frio + 10% FBS ao tubo de plástico para interromper a digestão.
   8. Use um suporte de pipeta acionado por bateria equipado com uma pipeta de 50 mL para aspirar a suspensão do tubo plástico. Equipar o tubo de plástico com um filtro de células de 400 μm e filtrar a suspensão para remover detritos. Repita o processo com um filtro de células de 100 μm.
   9. Centrifugar a suspensão filtrada a 400 x g por 5 min no RT. Ressuspender em 10 mL de PBS frio + 10% FBS e centrifugar novamente.
   10. Ressuspender em 8 mL de meio de cultura endotelial (mistura 1:1 de DMEM/F12 e kit endopan 3 + 10 U/mL de heparina + 20% de SFB + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de anfotericina + 30 mg/mL de suplemento de crescimento endotelial) suplementado com puromicina (4 mg/mL) para seleção populacional.
   11. Semeando as células de um camundongo em um frasco de cultura T25 previamente revestido com 2 mL de uma solução estéril de gelatina a 0,2% por 2 h a 37 °C e, em seguida, seco durante a noite em RT após a remoção do excesso de solução. Preparar os frascos no dia anterior ao isolamento.
   12. Após 24 h em condições de cultura padrão (37 °C, 20% O₂), remover o meio de suplemento de puromicina, lavar as células anexadas uma vez com PBS e cultivá-las em 8 mL de meio de cultura endotelial.
   13. Passar as células 1:5 em confluência de 80% para frascos revestidos com gelatina e utilizá-las em experimentos até P2. Use uma solução de descolamento celular diferente de tripsina (Tabela de Materiais) para remover as células do plástico de cultura de tecidos e não congelá-las.
7. Isolar macrófagos derivados da medula óssea.
   1. Se os fibroblastos tendinosos ou as células endoteliais não forem isolados do mesmo camundongo, execute as etapas 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 e 1.6.3 primeiro.
   2. Depois de remover a pele, o tendão e os tecidos musculares, lave os ossos restantes (fêmur e tíbia) uma vez em PBS frio (~4 °C).
   3. Coloque os ossos em PBS fresco e frio (~4 °C) e use um bisturi (No. 21) para cortar gradualmente as epífises até que a medula óssea seja exposta. Aparece como um ponto vermelho em ambos os lados do osso.
   4. Equipar uma seringa com uma agulha de injeção de 0,4 mm x 25 mm (G27) e preenchê-la com 10 mL de meio de cultura de macrófagos (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina + 1% aminoácidos não essenciais).
   5. Segure um osso após o outro sobre um tubo de plástico de 50 mL, insira a agulha de injeção a cerca de 1 mm de profundidade na medula óssea exposta na parte superior e lave a medula óssea esvaziando a seringa. A medula óssea ruborizada aparece como uma estrutura avermelhada semelhante a um tubo quando suspensa no meio.
   6. Dissolva a medula óssea pipetando-a suavemente para cima e para baixo repetidamente usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Use um suporte de pipeta acionado por bateria equipado com uma pipeta de 50 mL para filtrar a suspensão da célula através de um filtro de células de 100 μm de volta para o tubo de plástico de 50 mL e centrifuga-lo a 350 x g por 5 minutos no RT.
   7. Retire o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de tampão de lise de hemácias e centrifugue novamente a 350 x g por 10 min à temperatura ambiente.
   8. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio de cultura de macrófagos (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina + 1% aminoácidos não essenciais) e semeá-lo em placas de Petri não tratadas com 100 mm de diâmetro (5-8 x 10⁶ células por placa).
   9. Após 4 h, adicionar 5 mL de meio de cultura de macrófagos suplementado com 40 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (m-CSF) ao meio de cultura celular sem m-CSF (mistura 1:1) para chegar a uma concentração final de 20 ng/mL m-CSF.
   10. Após 6 dias, use as células em experimentos ou congele-as até novo uso. Use uma solução de descolamento celular diferente de tripsina (Tabela de Materiais) para remover as células do plástico de cultura de tecidos.
       Observação : uma vez isoladas, as células não se expandem mais. Os métodos de isolamento celular aqui descritos também funcionam com camundongos e ratos fora da faixa etária indicada.
8. Para verificar o fenótipo das populações celulares isoladas com citometria de fluxo, continue com a etapa 6.3.4.

2. Isolamento de colágeno de ratos Wistar ou Sprague-Dawley

1. Siga o protocolo de isolamento descrito em detalhes em outra parte⁸⁶. Ele também funciona com camundongos, embora com um rendimento muito menor.
2. Determinar a concentração da solução resultante com um ensaio de hidroxiprolina, avaliar a pureza com SDS-page e conservar a solução a 4 °C até à utilização nas experiências.

3. Produção dos componentes do sistema de cultura

1. Imprima em 3D os suportes de grampo, a estação de montagem e os moldes da câmara.
   1. Carregue o arquivo .stl anexado (Arquivo Suplementar 1) para os suportes de grampo, a estação de montagem e os moldes da câmara no software de fatiamento. Para adaptar os números de objeto conforme necessário, use apontar e clicar para selecionar objetos e copiar e colar para multiplicá-los.
   2. Pressione Exportar código G (Ctrl-R) para gerar o código G e, em seguida, exportá-lo (Ctrl-G).
   3. Carregue o código G em uma impressora 3D.
   4. Use filamentos biocompatíveis não coloridos para o processo de impressão (ou seja, ácido polilático).
   5. Corte roscas de 3 mm nos orifícios do suporte da braçadeira que irá transportar os parafusos usando um cortador de rosca (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, furos 1 e 3).
   6. Coloque pinos de cavilha de aço inoxidável no orifício na parte de trás do suporte da braçadeira (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, furo 4).
   7. Esterilize os suportes de fixação e a estação de montagem com luz UV por pelo menos 1 h antes do uso. Não reutilize suportes de braçadeira impressos em 3D.
   8. Alternativamente, produza os suportes de abraçadeiras e a estação de montagem com polieterimida usando os planos anexados (Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3 e Arquivo Suplementar 4), que é mais caro, mas permite melhores métodos de esterilização (ou seja, autoclavagem) e uso repetido.
2. Fundir as câmaras usando os moldes impressos em 3D.
   1. Encha os moldes da câmara com silicone.
   2. Desgaseifique o silicone em uma câmara de vácuo (90 mbar) por 30 min.
   3. Deixar a solução polimerizar em RT durante a noite ou em uma placa de aquecimento a 70 °C por 1 h, dependendo da resistência ao calor dos filamentos usados para os moldes.
   4. Retire cuidadosamente as câmaras polimerizadas dos moldes e corte o silicone supérfluo com bisturi (nº 21).
   5. OPCIONAL: Se os assembloides e, portanto, as câmaras circundantes forem carregados mecanicamente, reforce os orifícios nas câmaras de silicone com tubos ocos feitos de aço inoxidável.
3. Usine as abraçadeiras metálicas de aço inoxidável utilizando a planta anexa (Arquivo Suplementar 5).
4. Antes de cada uso, lave as abraçadeiras de aço inoxidável, os suportes de pinça de polieterimida, os parafusos e a câmara de silicone.
   1. Sonicate por 10 min em etanol 80% (EtOH) e água de osmose reversa a 20% (ROW).
   2. Sonicate por 10 min em EtOH 50% e Isopropanol 50%.
   3. Enxágue 3x com ROW.
   4. Sonicate por 10 min em concentrado de limpeza alcalina a 0,5% (ou seja, 3 mL em 600 mL de ROW).
   5. Sonicate por 10 min em concentrado de limpeza alcalina a 0,5%.
   6. Deixe em 0,5% de concentrado de limpeza alcalina enquanto agita por 1 h 50 min.
   7. Enxágue 3x com ROW.
   8. Sonicate por 10 min em ROW.
   9. Secar os componentes e autoclavá-los.

4. Fixação dos explantes do núcleo

1. Coloque suportes de fixação correspondentes juntamente com uma braçadeira de metal cada na estação de montagem.
2. Coloque pedaços de papel autoclavado molhado (4 mm x 25 mm) sobre as braçadeiras de metal e, em seguida, corte o papel ao longo das bordas internas das braçadeiras com um bisturi (nº 21). Corte 2 pedaços de papel adicionais menores (4 mm x 1,5 mm) de outro pedaço de papel e mantenha-os molhados.
3. Usando pinças pontiagudas, coloque 8 explantes de núcleo no papel entre as abraçadeiras de metal com seus pontos finais nas abraçadeiras de metal.
4. Cubra os pontos finais dos explantes do núcleo com os pedaços de papel menores colhidos (4 mm x 1,5 mm) e, em seguida, coloque grampos de metal sobre eles. Use uma chave de fenda e os pequenos parafusos (M3 x 6 mm) para fixar os explantes do núcleo entre as abraçadeiras metálicas e o suporte da braçadeira.
5. Transfira cuidadosamente os explantes do núcleo pinçado para as câmaras de cultura de silicone e preencha essas câmaras com 2 mL de meio de cultura celular padrão (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina + 1% anfotericina + 1% aminoácidos não essenciais).
6. OPCIONAL: Se os conjuntos/câmaras circundantes forem carregados mecanicamente, fixe-os com parafusos adicionais (M3 x 16 mm) no orifício 3 (Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, furo 3).

5. Preparação e fundição do hidrogel de colágeno

1. Retirar as células-alvo do plástico de cultura de tecidos com solução de descolamento celular, centrifugar-as a 400 x g por 5 min em RT e ressuspendê-las em 1 mL de meio de cultura padrão.
2. Para um assemblóide, são necessários 10 μL de PBS (20x), 1,28 μL de NaOH 1 M (125x), 8,72 μL de água bidestilada (ddH₂O, 23x), 80 μL de colágeno-1 (2,5x ou 1,6 mg/mL final) e 100 μL (2x) de meio de cultura padrão (para assembloides core // cell-free) ou suspensão celular. Prepare esses componentes em duas soluções separadas e misture-os apenas imediatamente antes da fundição.
   1. Solução de reticulação: Junte o PBS, o NaOH, o ddH₂0 e a suspensão celular de até 12 assemblóides (+10% de margem de segurança) em uma solução de reticulação e mantenha-a em um tubo plástico de 15 mL sobre gelo. Ajustar a concentração da suspensão celular para atingir as seguintes concentrações finais após a mistura das duas soluções: 250.000 células/mL de fibroblastos tendinos, 500.000 células/mL de células endoteliais derivadas do músculo ou 370.000 células/mL de macrófagos derivados da medula óssea.
   2. Solução de colágeno-1: Agrupar a solução de colágeno-1 necessária para até 12 assembloides (+10% de margem de segurança) em outro tubo plástico de 15 mL e mantê-la no gelo.
3. Uma vez que a solução de reticulação e a solução de colágeno-1 estejam prontas sobre gelo, aspirar o meio de cultura celular das câmaras de cultura contendo os explantes de núcleo pinçados.
4. Adicione a solução de colagénio-1 à solução de reticulação com uma pipeta de 1000 μL e misture as duas soluções pipetando para cima e para baixo rapidamente sem criar bolhas. Cobrir os explantes individuais do núcleo do tendão com 200 μL da solução mista, pipetando-a nos pomares fornecidos pelas câmaras de silicone.
5. Deixe os hidrogéis polimerizarem durante 50 min a 37 °C.
6. Preencher cuidadosamente as câmaras de cultura de silicone com 1,5 mL do respectivo meio de co-cultura, pipetando-o nos cantos das câmaras.
   1. Para co-cultura de núcleo // fibroblastos, preencher DMEM/F12, FBS 10%, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina/estreptomicina a 1%, anfotericina a 1%, ácido L-Ascórbico 200 μM, fator estimulador de colônia de macrófagos a 20 ng/mL.
   2. Para co-cultura de núcleo // macrófagos, preencher DMEM/F12, FBS 10%, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina/estreptomicina a 1%, anfotericina a 1%, ácido L-Ascórbico 200 μM, fator estimulador de colônia de macrófagos 20 ng/mL.
   3. Para a co-cultura de células endoteliais core//, preencher a mistura 1:1 de DMEM/F12 e o kit endopan 3 + 10 U/mL de heparina + 20% de SFB + 1% de penicilina/estreptomicina + 1% de anfotericina + 30 mg/mL de suplemento de crescimento endotelial.
7. Cultivar os assemblóides nas condições de cultura apropriadas para a hipótese. Para mimetizar um ambiente de nicho semelhante a uma lesão, por exemplo, cultive-os a 37 °C e 20% de_O2. Troque o meio de cultura duas vezes em 1 semana. Para evitar infecções, coloque as câmaras em uma grande placa de Petri ou uma caixa estéril antes de colocá-las em uma incubadora.
   NOTA: O tempo de cultura depende da hipótese e da configuração da co-cultura. Por exemplo, assemblóides de fibroblastos centrais em um ambiente de nicho semelhante a uma lesão tornam-se mecanicamente instáveis após cerca de 3 semanas.

6. Métodos de leitura disponíveis

1. Realizar microscopia de fluorescência, incluindo ensaios de viabilidade e morfologia.
   1. Em geral, os assembloides podem ser fotografados como montagens completas. Para isso, retire os assembloides das braçadeiras, cortando-as com tesouras próximas às pinças e transferindo-as para uma placa de 12 poços.
   2. Lave os assembloides uma vez com PBS.
   3. Se a análise de viabilidade for realizada, corar cada assemblóide com 100 μL de homodímero de etídio 4 x 10⁻⁶ M em PBS (EthD-1) por 20 min a 37 °C no escuro.
   4. Lavar os assemblóides 3x com PBS e, em seguida, fixá-los com 500 μL de formaldeído a 4% cada por 20 min em RT.
      CUIDADO: O formaldeído a 4% tem efeitos alergênicos, carcinogênicos e mutagênicos, é tóxico para a reprodução e pode causar toxicidade ao desenvolvimento (reprotoxic) ou danos aos órgãos. Use roupas e luvas de proteção, proteção ocular e máscara ou outra proteção respiratória.
   5. Lave os assemblóides 3x com PBS e continue com o protocolo de coloração de escolha. Uma seleção de colorações foi descrita anteriormente^84,85.
      OBS: Evitar colorações que utilizem fluoróforos com comprimento de onda de emissão próximo ao da autofluorescência do colágeno (em torno de 480 nm).
2. De acordo com as instruções do fabricante, execute o isolamento de RNA compartimento-específico para RT-qPCR ou sequenciamento de RNA em todo o genoma.
   1. Retire os assemblóides das braçadeiras com tesoura.
   2. OPCIONAL: Utilizar pinça para separar os explantes do núcleo do compartimento extrínseco de hidrogel.
   3. Pool 20-24 explantes de núcleo de 20 mm ou hidrogéis de colágeno carregados de 2 células para isolar quantidades suficientes de RNA.
   4. Use 1 mL de trizol frio e ruptura mecânica (ou seja, esferas metálicas ou moagem criogênica) para destruir a matriz extracelular dos explantes de núcleo agrupados ou os hidrogéis de colágeno agrupados.
      CUIDADO: Toxicidade oral, dérmica e por inalação. Causa irritação na pele e nos olhos. Apenas manuseie com luvas e em um armário de segurança química.
   5. Continuar com o isolamento de RNA do lisado celular usando kits de extração de RNA padrão, conforme descrito anteriormente ou conforme descrito nas instruções do fabricante ^84,85.
3. Citometria de fluxo compartimento-específica.
   1. Retire os assemblóides das braçadeiras com tesoura.
   2. OPCIONAL: Utilizar a pinça para separar os explantes do núcleo do compartimento extrínseco do hidrogel.
   3. Compartimentos de digestão em 1 mL de PBS com colagenase I (3 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) por 4 h a 37 °C sob agitação constante.
   4. Centrifugar a solução digerida a 500 x g durante 5 min em RT e aspirar o sobrenadante.
   5. Ressuspender o pellet em 100 μL de tampão FACS (FBS a 1% em PBS) contendo os anticorpos conjugados a fluoróforos de escolha. Uma seleção de anticorpos conjugados a fluoróforos em funcionamento foi descrita anteriormente^84,85.
   6. Incubar a solução corante por 30 min em TR.
   7. Diluir a solução corante com 1,4 ml de tampão FACS e centrifugar-a durante 5 minutos a 500 x g em RT.
   8. Ressuspender o pellet em 350 μL de tampão FACS e filtrar a solução através de uma tampa de filtro de malha de nylon de 100 μm antes de analisá-la com o citômetro de fluxo de escolha de acordo com as instruções do fabricante.
4. Analise o sobrenadante.
   1. Substituir o meio de co-cultura por meio de co-cultura sem soro 3 dias antes da coleta do sobrenadante.
   2. Realizar análise imediata e tardia do sobrenadante enriquecido e não diluído com kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) e de descoberta em escala meso (MSD). Para a análise tardia, armazenar o sobrenadante em tubos plásticos de 1,5 mL a -80 °C.
5. Avaliar as propriedades mecânicas do assemblóide.
   1. Use um dispositivo de alongamento feito sob medida para aplicar forças mecânicas e medir propriedades mecânicas²². Os pinos de aço inoxidável e os parafusos de aço inoxidável tornam as abraçadeiras acopláveis a outros dispositivos de alongamento também.
   2. Como as propriedades mecânicas do assemblóide são largamente determinadas pela do explante de núcleo embutido ¹⁸, meça as propriedades mecânicas do explante de núcleo antes de incorporá-lo em um hidrogel para diminuir o risco de destruir o hidrogel recém-fundido no processo de medição.

Discussion

De modo geral, o sistema de modelos assemblóides aqui apresentado tem várias etapas críticas a destacar. Primeiro, o sistema de modelos é tão bom quanto a qualidade de seus componentes. É vital verificar o explante do núcleo e as populações de células a serem semeadas sob o microscópio antes de iniciar o processo de montagem. Da mesma forma, é importante verificar o fenótipo das populações celulares isoladas pelo menos uma vez com citometria de fluxo. Especialmente quando um novo lote de colágeno-1 é usado pela primeira vez, é vantajoso verificar a velocidade de reticulação em uma execução experimental antes de incorporar células nele. A montagem assemblóide requer muito manuseio manual, o que aumenta o risco de infecções. Para minimizar o risco de infecções, trabalhe em uma capela de biossegurança estéril com fluxo de ar laminar, troque luvas com frequência e descontamine as luvas, bem como o espaço de trabalho com etanol 80%. Por razões semelhantes, não use os suportes de braçadeira impressos em 3D mais de uma vez. Antes do processo de incorporação propriamente dito, é importante manter todos os componentes do hidrogel (solução de reticulação, solução de colágeno-1) no gelo para evitar ligações cruzadas prematuras. Consequentemente, deve-se trabalhar rapidamente uma vez que as células são adicionadas à solução de reticulação para limitar a morte celular devido ao pH elevado e à baixa temperatura da solução de reticulação. Para evitar a morte celular relacionada à secagem no explante do núcleo, aspirar o meio que cobre os explantes do núcleo pinçado imediatamente antes de misturar a solução de reticulação com a solução de colágeno-1. Para garantir a colocação central do explante do núcleo dentro do hidrogel, o ideal é lançar o hidrogel em torno de um explante de núcleo fixo que seja levemente tensionado. Para isso, use o pino de cavilha e o parafuso M3 x 16 mm para fixar os suportes de fixação a uma placa (impressa em 3D) com furos nos comprimentos apropriados. Após o tempo de polimerização de 50 min, o explante do núcleo embutido pode ser destensionado novamente, dependendo das condições de cultura desejadas. A quantidade de tensão que o assemblóide experimenta durante o cultivo tem um profundo impacto nos resultados experimentais e deve ser mantida uniforme entre amostras e condições²¹.

No entanto, o grande impacto do (des)carregamento mecânico nos resultados experimentais é uma das principais vantagens do modelo assemblóide sobre a maioria das alternativas de engenharia tecidual, especialmente porque a composição da matriz mantida do explante central também deve recriar os complexos padrões de carregamento in vivo no nível celular⁹⁰. Enquanto na prática apenas a medida do módulo de elasticidade linear, a tensão máxima de tração e a tensão máxima de tração dos assemblóides foram demonstradas até o momento, protocolos para medidas de força de fadiga e relaxamento de tensão foram descritos para explantes de tendão central em outros lugares e devem ser aplicáveis aos assemblóides^91,92. Além dos padrões de carregamento in vivo, a modularidade multinível do assembloid é provavelmente sua maior vantagem. Graças às câmaras de cultura individuais, um conjunto controlável de condições de nicho pode ser definido para cada amostra separadamente (ou seja, temperatura, tensão de oxigênio, concentração de glicose, suplementação, estimuladores, inibidores e estiramento estático com uma placa). Em seguida, a rigidez da matriz e a composição da matriz do compartimento extrínseco são personalizáveis através da composição do hidrogel e permitiriam, por exemplo, estudar o impacto de um microambiente tecidual cada vez mais doente incorporando mais colágeno-3 e fibronectina celular 93,94,95. As populações celulares avaliadas no compartimento extrínseco são facilmente adaptáveis selecionando quais células semear, mas também podem ser modificadas no explante do núcleo do tendão aproveitando linhagens celulares geneticamente modificadas estabelecidas e linhagens de camundongos (i.e., depleção de células ScxLin)⁹⁶. A diferente matriz e composição celular dos dois compartimentos fornece ainda uma estrutura 3D compartimentada única, que é outra característica do tendão central ^1,30,46.

Ao usar esse sistema, é importante considerar as consequências da modularidade do sistema para a granularidade dos parâmetros de resultado. Enquanto a proliferação e o recrutamento celular podem ser avaliados para cada compartimento separadamente, as propriedades mecânicas, os componentes do secretoma e os produtos de degradação são atualmente mensuráveis apenas para o assemblóide completo. Em relação ao rendimento, uma pessoa devidamente treinada pode preparar até 50 assembloides em um dia de trabalho regular, sendo o principal gargalo o procedimento de fixação. Embora alguns dos métodos de leitura sejam mutuamente exclusivos, é possível avaliar propriedades mecânicas e componentes do secretoma repetidamente na mesma amostra, bem como a composição da população celular (citometria de fluxo), transcriptoma celular (RT-qPCR, sequenciamento de RNA) ou matriz e distribuição celular (imunocitoquímica/microscopia de fluorescência) nos endpoints. Em publicações anteriores, esses métodos foram empregados para caracterizar extensivamente interações intercelulares e compartimentais cruzadas em assemblóides de núcleo // fibroblasto e núcleo // macrófagos expostos a um nicho semelhante a uma lesão^84,85. Neste trabalho, a capacidade do sistema modelo assemblóide de sondar a interação compartimental cruzada entre o núcleo e as células endoteliais extrínsecas sob diferentes estímulos microambientais foi explorada.

A modularidade do sistema modelo permite o refinamento futuro do método, o que é necessário para superar as seguintes limitações da iteração de projeto atual. A análise por citometria de fluxo apresentada neste trabalho e os dados de sequenciamento de RNA unicelular publicados recentemente revelaram que os tenócitos residentes no núcleo do tendão e as populações derivadas do tendão de Aquiles são mais heterogêneas do que se supunha anteriormente24,34,59,84,97. Além disso, o comportamento migratório de populações celulares inicialmente residentes no núcleo ou no hidrogel obscurece a compartimentalização do assemblóide durante o cultivo. Ambos os fatores juntos tornam desafiador atribuir diferenças transcriptômicas a tipos celulares específicos e separar processos baseados em proliferação e migração. Essa limitação poderia ser superada refinando a população de entrada com a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) com base na composição celular de tendões saudáveis ou doentes caracterizados em estudos in vivo recentes, melhorando a leitura implementando o sequenciamento de RNA de célula única e integrando marcadores de proliferação como uma coloração de EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) durante a microscopia.

Os assemblóides aqui apresentados também compartilham uma fraqueza com a maioria dos sistemas in vitro atualmente disponíveis que simulam órgãos doentes desconectados do resto do corpo^98,99. No entanto, a plataforma baseada em câmara de cultura usada aqui posiciona bem o sistema modelo para integração em uma plataforma de múltiplos órgãos, onde assembloides imitando diferentes órgãos são conectados e interações interórgãos podem ser estudadas.

Em sua essência, o sistema modelo é baseado em tendões de roedores posicionais, o que resulta em seu próprio conjunto único de desvantagens. Primeiro, a traduzibilidade dos resultados é prejudicada por camundongos selvagens que não se desenvolvem ou sofrem de doenças tendíneas ^8,100,101. A integração de tecidos e células de humanos ou linhagens de camundongos recém-desenvolvidas que exibem aspectos de doença tendínea poderia aliviar esse problema¹⁰². A mudança para um assemblóide baseado em humanos é particularmente interessante, pois permitiria estudos com tecidos derivados de pacientes de tendões doentes diferentes (ou seja, tendinite, tendinose ou peritendinite) e até mesmo doadores resistentes ao tratamento que poderiam desbloquear programas de tratamento mais personalizados. Em segundo lugar, os explantes do tendão da cauda murina não lidam particularmente bem com microdanos induzidos por sobrecarga, o que limita a aplicabilidade do sistema modelo para o estudo de danos agudos ao tendão.

Por todas essas razões, os explantes // assemblóides de hidrogel estão em uma posição privilegiada para estudar a biologia do núcleo do tendão, interações estrutura-função da matriz e interações intercompartimentais entre populações celulares específicas em resposta a microdanos induzidos por nicho. Os insights coletados a partir desses estudos de alto rendimento podem dar direção à pesquisa in vivo e ao desenvolvimento de tratamentos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27)	Sterican	9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament	Prusa	NA
4% formaldehyde	Roti-Histofix	P087.4
Accutase cell detachment solution	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amphotericin	VWR	L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2	Motic	NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel	RS PRO	1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel	RS PRO	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	102413
CD86 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone	KauPO	09301-004-000001
Endopan 3 Kit	Pan-Biotech	P04-0010K
Endothelial cell growth supplement	Lonza	CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse	BioLegend	123151
Falcon plastic tube (15 mL)	Corning	352096
Falcon plastic tube (50 mL)	Corning	352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Gelatin	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate	Sigma	Z805939-1EA
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Hydroxyproline assay	Sigma-Aldrich	MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM non-essential amino acids	Sigma	7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
MSD assay	Mesoscale Discovery	various
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm	Corning	734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer	Prusa	i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L	Gibco	10010001
Puromycin	Gibco	A1113803
RBC lysis buffer	VWR	786-650
recombinant m-CSF	PeproTech	315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Slicing software: PrusaSlicer	Prusa	NA	Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm	Fisherbrand	22363549
Surgical scalpel blade No. 21	Swann-Morton	307
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %)	Gibco	15400054