ההתקדמות הטכנית האחרונה אפשרה ייצור בקנה מידה גדול של פלטפורמת מבחנה עבור מטבוליזם של תרופות ויישומי רעילות. מערכת כבד דו-ממדית + אנושית (TV2D+) מספקת תוצאות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית באמצעות שיטות תרבית דו-ממדיות מסורתיות. פרוטוקול זה יתמוך במשתמשי קצה בהגדרה, תחזוקה ויישום של המערכת.
מציאת מודל תרבית ארוך טווח ורלוונטי לבני אדם עבור הפטוציטים אנושיים ראשוניים (PHHs) למחקרים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים נותרה אתגר. פלטפורמות מודל מבחנה נוכחיות הן לעתים קרובות לא נוחות ומורכבות, חסרות יציבות פנוטיפית לאורך זמן, ואינן תומכות במספר מגרשי PHH, חסרות יכולת שחזור ניסיונית וגמישות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפשרה, ציפוי ותחזוקה של מערכת כבד דו-ממדית + אנושית (TV2D+), המנצלת טכניקות וציוד סטנדרטיים של תרבית דו-ממדית (2D) תוך שמירה על תוחלת חיים ארוכה ויציבות פנוטיפית לאורך זמן המלווים בדרך כלל מערכות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) מורכבות יותר. התוצאות מראות התקשרות ואחוזי לוחית ב- TV2D+ כפונקציה של צפיפות הזריעה של PHH, כמו גם פונקציונליות יציבה למשך שבועיים לפחות בתרבית. מגוון של צפיפויות זריעה PHH מוערכים כדי להשיג תרבות מוצלחת לטווח ארוך. כאשר הם מבוססים כראוי, ה-PHHs ב-TV2D+ מתארגנים במושבות הפטוציטים, מבטאים סמן ספציפי לכבד ושומרים על כדאיות, שלמות אדריכלית ורמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית של אלבומין ואוריאה. שילוב תכונות ייחודי זה הופך את מערכת TV2D+ למודל כבד מתאים למגוון יישומים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים.
חיזוי הבטיחות והיעילות הטיפולית הוא חלק חשוב בפיתוח תרופות פרה-קליניות. עם זאת, מודלים פרה-קליניים קונבנציונליים במבחנה של הכבד מוגבלים ביכולתם לחקות במדויק את המיקרו-סביבה התאית in vivo של הכבד ולשמור על פונקציונליות ומורפולוגיה של הפטוציטים לאורך זמן. יש צורך במודלים המספקים יכולת מטבולית יציבה במשך יותר משבוע כדי להעריך תרכובות בעלות מחזור איטי או לחקור תוצאות הקשורות לחשיפה תת-חריפה או כרונית. ניסויים בבעלי חיים In vivo נכשלים לעתים קרובות בחיזוי יעילות התרופה והסיכון בשל הבדלים בין מינים תרגומיים במנגנוני פינוי הכבד האנושיים1. מודלים דו-ממדיים (2D) של הכבד הנוכחיים במבחנה, כגון מונוקולטורה מסורתית של הפטוציטים אנושיים ראשוניים (PHH) או תרביות סנדוויץ', חסרים יציבות פנוטיפית ואריכות ימים בתרבית, מה שמוביל לאובדן תפקוד הפטו-תאי מרכזי ושלמות אדריכלית לאורך זמן2. שיטה חלופית כוללת היווצרות של ספרואידים הפטוציטים תלת-ממדיים (3D), המציעים מיקרו-סביבה רלוונטית יותר לעומת תרבית דו-ממדית. עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי זמינות של חומרי גלם, בחירת PHH תורם לוט, שחזור, ואובדן כדאיות עם הגדלת גודל הספרואיד 3,4,5,6. הוצגו פלטפורמות רב-תאיות שבהן PHHs נזרעים עם תאי הזנה על לוחות בגודל קבוע ומיקרו-דפוסים. למרות שמודלים אלה עשויים לאפשר זמני תרבית ארוכים יותר, תאי הזנה לא אנושיים המשמשים בפלטפורמות אלה יכולים לשנות את תוצאות הניסויים ולהגביל את יישומם בשל תרומת רקע מולדת לסילוק תרופות ופרופילים מטבוליים 1,7. מערכת הכבד הדו-ממדית הכל-אנושית TruVivo (TV2D+) שתוארה לאחרונה ב-Weaver, et al8, פותחה כדי להתמודד עם חלק מהמגבלות של שיטות מסורתיות, תרבות משותפת ותרבות תלת-ממדית של PHHs. התאים שאינם מזינים את הכבד מפחיתים את ההבדלים בין המינים בחילוף החומרים ובייצור הפרקרינים ומספקים את התמיכה הדרושה להפטוציטים ראשוניים בצורה חזקה הניתנת לשחזור, שאינה יכולה להיות מסופקת על ידי תאי כבד מקבילים שאינם פרנכימליים מתורם יחיד עקב מגבלות בהרחבה, בפנוטיפ ובביצועים. תאי ההזנה שנבחרו היו מסוגלים להתרחב באופן עקבי לפני השימוש וחסרו את הצורך בטרנספורמציה או התמיינות. כפי שתואר על ידי Glicklis et al.4 ו- Khetani et al.5, מודלים של תרבית תלת ממדית כמו ספרואידים hepatocyte יש אתגרים עם רבייה עקב השתנות התורם ושמירה על עקביות בגודל הספרואידים, אשר משפיע על דיפוזיה תזונתיים ב spheroids גדול מ 200 מיקרומטר, המוביל לירידה בכדאיות ופונקציונליות. בדומה להיווצרות ספרואידים תלת-ממדיים, מערכת TV2D+ מסתמכת על הרכבה עצמית של PHHs; עם זאת, מושבות PHH שנוצרו מפוזרות על פני שטח הפנים של הבאר בעומק תא בודד ולא דחוסות לצבר יחיד. שיטת תרבית זו עשויה להיות שימושית כדי לטפל בשונות התורמים, ולאפשר ל-PHHs להיות מצופים, מתורבתים ולשמור על פונקציונליות בסיסית בצפיפויות זריעה שונות. מערכת TV2D+ עשויה גם להגביר את החוסן של הטיפול במשתמשים עקב אובדן במהלך מניפולציה או ציוד מיוחד הנדרש לביצוע תרבית מורחבת בכדוריות תלת-ממדיות.
מערכת TV2D+ משלבת תרבות דו-ממדית סטנדרטית עם אריכות ימים ויציבות פנוטיפית המלוות בדרך כלל מערכות תלת-ממדיות. הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות שלב אחר שלב למשתמשים עם מיומנויות בסיסיות של תרביות רקמה במעבדות המצוידות בציוד סטנדרטי כגון ארונות בטיחות ביולוגית, צנטריפוגות ואינקובטורים של CO2 . כל שלב בתהליך מתואר בפירוט, כולל הכנת מדיה, הפשרה, ציפוי ותחזוקה של מערכת התרבות המתקבלת. הפרוטוקול מכיל גם שיטה לקביעת תפוקות פונקציונליות בסיסיות של הפטוציטים, אלבומין ואוריאה, כמו גם ניתוח תמונה אימונופלואורסצנטית לקביעת התקשרות PHH לנורמליזציה. כאשר הם מבוססים כראוי, ה- PHHs ב- TV2D+ מתארגנים במושבות הפטוציטים, מחקים את המורפולוגיה הטבעית של הכבד, ושומרים על כדאיות מורחבת, שלמות אדריכלית ורמות רלוונטיות פיזיולוגית של אלבומין ואוריאה למשך שבועיים לפחות8. מכיוון שהמערכת יכולה לאפשר מגוון של צפיפויות זריעה של PHH, היא עשויה להיות שימושית בהגדלת הזמינות של מגרשי PHH פחות ניתנים לציפוי בעלי מאפיינים רצויים של תורמים. שילוב זה של נגישות ופונקציונליות הופך את TV2D+ למודל כבד מתאים למגוון יישומים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים.
פרוטוקול זה תואם את הנחיות ועדת האתיקה של Lifenet Health. כתב היד אינו מכיל מחקרים עם משתתפים אנושיים או מחקרים בבעלי חיים שבוצעו על ידי מי מהמחברים. כל התאים בודדו מרקמת תורם בהסכמה מלאה למטרות מחקר על ידי Lifenet Health.
1. הכנה בינונית
2. הפשרה, ספירה וציפוי של תאי הזנה אנושיים (איור 1A)
3. הפשרה, ספירה וציפוי של הפטוציטים אנושיים ראשוניים (איור 1B)
4. תחזוקה
5. איסוף דגימות תרבית למדידת אלבומין ואוריאה
6. יום מכתים I
זהירות: מאגר הקיבוע מכיל Paraformaldehyde. פרפורמלדהיד עלול לגרום לנזק לעיניים, לגירוי בעור ולהרעלת איברים. עבוד באזור עם אוורור טוב ולבש ציוד הגנה אישי מתאים (PPE).
7. יום מכתים II
8. ניתוח ImageJ (איור 2)
הערה: מומלץ להשתמש ב-ImageJ גרסה 1.52a ואילך.
9. כימות סך כל הפטוציטים המחוברים ואחוז ההתקשרות (לוחית)
10. בדיקת אלבומין
11. בדיקת אוריאה
אזהרה: מגיב חומצה חנקן אוריאה בדם (BUN) מכיל חומצה גופרתית. ריכוז החומצה הגופרתית בריאגנט חומצה BUN נחשב קורוזיבי. אין לבלוע. עבודה באזור עם אוורור טוב ללבוש PPE מתאים.
השיטה הכוללת של ציפוי, תרבית ובדיקת פונקציונליות בסיסית של מערכת תרביות הכבד כוללת טכניקות וניתוח נפוצים של תרביות תאים ראשוניות, כפי שמודגם באיור 1. חיבור הפטוציטים ואחוזי הצלחת חושבו ביום ה-14 באמצעות ניתוח ImageJ של לפחות חמש תמונות של צביעת ציטוקרטין 18 ו-DAPI לכל באר (איור 2). תמונות מייצגות של PHHs בתרבית עם תאי הזנה מוצגות באיור 3. צפיפויות הזריעה השונות בכבד הראו הבדלים חזותיים של מפגש בהתבסס על צפיפות הזריעה ושמרו על מורפולוגיה כבדית קובואידית טיפוסית במשך 14 ימי תרבית. תמונות של מגרשים A ו-B של תורמי כבד צולמו עבור כל צפיפות זריעה שנבדקה (איור 4A). אחוז הצלחתיות הממוצע של תורם B (89.04% ± 3.99%, 198,552 ± 49,885 PHHs) היה גבוה יותר מתורם A (66.08% ± 6.67%, 146,128 ±-33,063 PHHs) בכל צפיפויות הזריעה שנעשה בהן שימוש (איור 4B). לתורם א' הייתה אחוזי צלחות גבוהים משמעותית באמצעות 150,000 PHHs/באר (76.07% ±-12.87%) בהשוואה ל-250,000-300,000 PHHs לבאר (62.75% ±-9.64%). תורם B לא הראה הבדלים משמעותיים באחוזי הצלחת של הפטוציטים. תורם B היה בעל צלחות הפטוציטים הנמוכה ביותר (85.78% ± 13.25%) בצפיפות הזריעה הגבוהה ביותר, 300,000 PHHs / באר. בדומה לתורם א', זריעת תורם B ב-150,000 PHHs/באר הייתה בעלת אחוזי הצלחת הגבוהים ביותר של הפטוציטים (94.75% ±-15.07%).
ייצור אלבומין וסינתזה של אוריאה נמדדו בשלוש נקודות זמן במהלך תקופת התרבית בת 14 הימים ונורמלו להפטוציטים מחוברים מחושבים. בסך הכל, תורם A הגדיל את ייצור האלבומין בהשוואה לתורם B (41.32 ± 4.58 מיקרוגרם alb/day/106 PHHs לעומת 34.66 ± 10.03 מיקרוגרם alb/day/106 PHHs) (איור 5). לתורמים A ו-B הייתה תפוקת האלבומין הגבוהה ביותר בזריעת הפטוציטים ב-150,000 PHHs/well, 45.91 ± 5.96 מיקרוגרם alb/day/106 PHHs ו-48.67 ± 20.44 מיקרוגרם alb/day/106 PHHs, בהתאמה. לא נצפו הבדלים משמעותיים בייצור אלבומין בצפיפות הזריעה בה נעשה שימוש. כפי שצוין על ידי Baudy et al.3, רצוי כי מערכות מיקרופיזיולוגיות בכבד לשמור על ייצור אלבומין עקבי סינתזת אוריאה עם פחות מ 50% שינוי במשך 14 ימים של תרבית. מקדם השונות (CV) חושב על ידי חלוקת הממוצע בסטיית התקן לימים 7, 10 ו-14. כל הדגימות הופעלו בכפילויות. קורות החיים של תפוקת אלבומין במהלך 14 ימי תרבית של 150,000 PHHs לבאר היו 12.24% עבור תורם A ו- 37.97% עבור תורם B, פחות מהקריטריון הרצוי של 50%. שונות גבוהה בייצור אלבומין נצפתה הן בתורם א' והן בתורם ב' כאשר זרעו 250,000 ו-300,000 PHH/באר. בצפיפות זריעה זו, שני התורמים חווים ירידה תלולה בייצור אלבומין בין הימים 7, 10 ו-14 של תרבית (תורם CV א', 22.49%, ותורם ב', 45.07%).
סינתזת אוריאה של תורם B (95.09 ± 18.91 מיקרוגרם אוריאה ליום/106) הוגדלה בהשוואה לתורם A (64.92 ± 4.66 מיקרוגרם אוריאה ליום/106 PHHs) בממוצע ימים 7, 10 ו-14 PHH נתונים ספציפיים (איור 6). תורם B (113.49 ± 37.34 מיקרוגרם אוריאה ליום/106 PHHs) ותורם A (69.12 ± 17.06 מיקרוגרם אוריאה ליום/106 PHHs) היו בעלי סינתזת האוריאה הגדולה ביותר במהלך תקופת תרבית של 14 יום בצפיפות של 150,000 PHHs / באר ו -200,000 PHHs / באר, בהתאמה. שני המגרשים התורמים היו בעלי תפוקת האוראה הנמוכה ביותר וקורות החיים הגבוהים ביותר של 300,000 PHHs / באר. לא נצפו הבדלים משמעותיים בסינתזת אוריאה בצפיפות הזריעה בה נעשה שימוש. קורות החיים הנמוכים ביותר עבור סינתזת אוריאה עבור תורם A נצפו בתרבית של 250,000 PPHs / באר (23.11%) ו -200,000 PHHs / באר עבור תורם B (28.26%). כפי שמודגש על ידי תוצאות אלה, צפיפות זריעה אופטימלית עבור הרבה נתון של PHH תלויה ברמת המפגש הרצויה בזמן הבדיקה ואת אופי התוצאות הנמדדות; צפיפות זריעה גבוהה יותר לא תמיד מתואמת עם אות גבוה יותר או טווח דינמי גבוה יותר.
איור 1: תרשים זרימה של ציפוי, תרבית ובדיקה תפקודית של הפטוציטים עם תאי הזנה. (A) תאי הזנה מופשרים בתווך הפשרה מסוים (ראו טבלת חומרים), מרחפים מחדש באמצעי ציפוי שלם (ראו טבלת חומרים), והתאים נספרים. התאים מדוללים, מצופים ומודגרים במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C/5% CO2. (B) הפטוציטים מופשרים בתווך הפשרה מסוים (ראו טבלת חומרים), מרחפים מחדש בתווך ציפוי שלם, והתאים נספרים. הפטוציטים מדוללים ומצופים בתאי הזנה. התאים מודגרים במשך 2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C/5% CO2, ורועדים בתנועת N-S-E-W כל 15 דקות במשך 60 הדקות הראשונות של התרבית. מדיום הציפוי מוחלף במדיום תרבית שלם שחומם מראש לתחזוקת התרבות (ראה טבלת חומרים). התרבויות מוזנות מדי יום. (C) בימים 7, 10 ו-14 נאספות דגימות בינוניות לבדיקת אלבומין ואוריאה. לאחר איסוף הדגימות ביום ה-14, התאים קבועים ומוכתמים בנוגדן ציטוקרטין 18 (ראה טבלת חומרים) 16-24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. יתר על כן, הם מודגרים בנוגדן משני מתאים, נשטפים ומותקנים עם DAPI (ראה טבלת חומרים) ללכידה וניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ. עיבוד ImageJ של תמונות שצולמו. שלב 1: קנה מידה מוחל על כל התמונות בהתבסס על סרגל קנה המידה הספציפי למיקרוסקופ. שלב 2: סוג התמונה משתנה. שלב 3: מגבלת סף מוחלת על חלקיקי DAPI נבחרים. שלב 4: ניתוח חלקיקים מבוצע, והספירה נרשמת. שלב 5: כדי לקבוע את מספר תאי ההזנה המחוברים, תמונה ממוזגת נספרת באמצעות הכלי הרב-נקודתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה של צפיפויות שונות של זריעת כבד בתרבית עם תאי הזנה. תמונות מייצגות בימים 7 ו-14 של PHHs בתרבית עם תאי הזנה (50,000 תאים / באר) בצפיפות זריעה בכבד של 150,000, 200,000, 250,000 ו- 300,000 PHHs/בארות. התמונות צולמו באמצעות עדשה אובייקטיבית 10x במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אימונוציטוכימיה פלואורסצנטית של צפיפויות זריעה שונות בכבד בתרבית עם תאי הזנה. (A) תמונות מייצגות של צביעת ציטוקרטין 18 (אדום) ביום ה-14 בצפיפות זריעה בכבד של 150,000, 200,000, 250,000 ו-300,000 PHHs/בארות. שתי בארות לכל צפיפות זריעה נקבעו למשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. בארות הודגרו 16-24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני ב 1:1000. נוגדן משני שימש בשעה 1:500 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. DAPI (כחול) כתם גרעיני נוסף לבארות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. התמונות צולמו באמצעות עדשה אובייקטיבית 10X במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) הפטוציטים מחוברים מחושבים ואחוזי הצלחתיות של צפיפויות זריעה שונות בכבד שחושבו באמצעות ImageJ. *p ≤ 0.05, לאחוזי צלחת עבור 200,000, 250,000 ו-300,000 PHH/באר. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n ≥ 5 תמונות לכל תנאי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ייצור אלבומין של הפטוציטים בתרבית עם תאי הזנה. הפקת אלבומין מצפיפויות זריעה בכבד ב 150,000, 200,000, 250,000, ו 300,000 PHHs / באר. עמודות מייצגות את הממוצע של 14 יום של מיקרוגרם אלבומין ליום מנורמל לסך כל הפטוציטים המחוברים. שורה מייצגת קורות חיים בין הימים 7, 10 ו-14. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n ≥ 2 בארות לכל תנאי עם עותקים משוכפלים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סינתזת אוריאה של הפטוציטים בתרבית עם תאי הזנה. סינתזת אוריאה מצפיפויות זריעה בכבד ב 150,000, 200,000, 250,000, ו 300,000 PHHs / באר. עמודות מייצגות ממוצע של 14 יום של אוריאה מיקרוגרם ליום מנורמל לסך כל הפטוציטים המחוברים. שורה מייצגת % CV בין הימים 7, 10 ו-14. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n ≥ 2 בארות לכל תנאי עם עותקים משוכפלים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סטנדרט (S) # | ריכוז (מק"ג/מ"ל) | תמיסת אוריאה (μL) | תרבות שלמה (μL) |
1 | 100 | 53.3 75 מ"ג/ד"ל מלאי | 346.7 |
2 | 50 | 100 (פתרון S1) | 100 |
3 | 25 | 100 (פתרון S2) | 100 |
4 | 12.5 | 100 (פתרון S3) | 100 |
5 | 6.26 | 100 (פתרון S4) | 100 |
6 | 3.125 | 100 (פתרון S5) | 100 |
7 | 1.5625 | 100 (פתרון S6) | 100 |
ריק | 0 | 0 | 100 |
טבלה 1: הכנת מדגם סטנדרטי של אוריאה. באמצעות 75 מ"ג / ד"ל ציר אוריאה, להכין תמיסת אוריאה 100 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot את הנפחים המוצעים כדי להגיע לריכוז הסופי עבור העקומה הסטנדרטית.
מערכת תרבית הכבד המתוארת ניתן להקים במעבדות המצוידות במכשור תרבית רקמות סטנדרטי. המערכת, המורכבת מתאי PHH המתורבתים עם תאי הזנה, מאפשרת למשתמש לגדל PHHs במשך שבועיים לפחות עם ייצור אלבומין יציב וסינתזה של אוריאה. בגלל השונות בכמות התורמים PHH, רק PHHs מסוננים מראש ומוסמכים מומלצים לשימוש במערכת. למרות שמספר ה-PHHs המחוברים משתנה בהתאם לכמות התורם ולצפיפות הזריעה, יכולת הציפוי היחסית נשארת דומה בכל חלקת תורם. בעוד צפיפות הזריעה המומלצת מומלצת, הנתונים לעיל מצביעים על כך שניתן להתאים את צפיפות זריעת הפטוציטים לצרכים ניסיוניים שונים; עם זאת, יש לציין כי זריעת מספר גדול יותר של PHHs עשויה שלא לספק תפוקות פונקציונליות גבוהות או עקביות יותר. ניתוח של מגרשי PHH שהוערכו הראה את קורות החיים הנמוכים ביותר לייצור אלבומין וסינתזה של אוריאה באמצעות צפיפות זריעה נמוכה יותר של 150,000 PHHs / באר ו 200,000 PHHs / באר; עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בין אלבומין ואוריאה בכל צפיפות זריעה. צפיפות זריעה גבוהה יותר של 250,000 PHHs/באר ו-300,000 PHHs/well מראה ירידה גדולה יותר באלבומין ובאוריאה במהלך תקופת התרבית בת 14 הימים. שונות אינהרנטית של התורם בצלחות עשויה להשפיע על עקביות ייצור האלבומין וסינתזה של אוריאה ב-250,000 PHHs/well ו-300,000 PHHs/well עבור מנות התורם שנבדקו. בדומה לכדורואידים גדולים של הפטוציטים, לפיקוח על PHHs במערכת TV2D+ עלולות להיות השפעות שליליות על התרבות והפונקציונליות ארוכות הטווח של PHHs.
כל השלבים בהפשרה, בציפוי ובתחזוקה הם קריטיים לתרבות מוצלחת וליצירת נתונים; עם זאת, ישנן מספר טעויות נפוצות שמשתמשים חסרי ניסיון יכולים להימנע מהן. PHHs רגישים מאוד לנזק משני לתנודות טמפרטורה, לחץ גזירה וחשיפה לאוויר 9,10. יש לנקוט אמצעי זהירות בעת הפשרת PHHs כדי למנוע מסגרות זמן הפשרה ממושכות ופיפטינג מוגזם. השימוש בשיטת מזיגה ידנית, טיימר והעברה מיידית מאמבט מים לקרח יפחיתו את הטעויות הנפוצות הללו שיכולות להשפיע על הכדאיות והציפוי של PHHs. בנוסף, כאשר בעיות בשרשרת האספקה הופכות נפוצות יותר, ייתכן שיהיה קשה להשיג צלחות מצופות קולגן. ניתן להשתמש בציפוי ידני של לוחות שטופלו בתרבית רקמה באמצעות פתרונות מסחריים של קולגן מסוג I (5-10 מיקרוגרם לסמ"ק2) כדי להתגבר על בעיה זו; עם זאת, לביצועים ועקביות מיטביים, מומלץ להשתמש בלוחות קולגן מצופים מראש. בתהליך המעבר מתרבית תאי הזנה בלבד להכנסת PHHs, חיוני למנוע התייבשות שכבת תאי ההזנה. לעולם אל תאפשר חשיפה לאוויר לתאי ההזנה. כל זמן חשיפה לאוויר עלול להוביל לאיכות ירודה של שכבת תאי ההזנה, מה שישפיע לרעה על התרבית ארוכת הטווח של PHHs. מומלץ לאפשר כמות קטנה של תווך שיורי להישאר בין שינויים בינוניים. לעיתים, PHHs עשויים להכיל פסולת עודפת מבידוד, מה שעלול להקשות על הצפייה במורפולוגיה. כדי לעזור עם בעיה זו, לנער את הצלחת לפני שינוי בינוני ולהשתמש שאיפת ואקום. לבסוף, בעת ביצוע שינוי בינוני, בזהירות לשאוף את המדיום בילה נזהר לא להפריע תאים בתרבית. פיפטה טרייה בנפח בינוני במורד דופן הבאר כדי למנוע פיפטציה ישירות על שכבת התא. כמו כן, על המשתמש להימנע מחשיפה לאוויר בכל שינוי בינוני, באמצעות שינוי 3 בארות מומלץ (סעיפים 3 ו-4). כמו כן יש לציין כי שינוי יומי בינוני הוא אידיאלי אך לא נדרש.
למרות שמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפך נפוץ ברוב המעבדות, תוכנה הדרושה לביצוע ניתוח תמונה ספציפי עלולה להיות כרוכה בהוצאות נוספות. ניתן להוריד את ImageJ בחינם, מה שהופך אותו לכלי ניתוח תמונה נגיש בקלות. השלבים בפרוטוקול מספקים בסיס שאליו המשתמש עשוי להזדקק לאופטימיזציה, במיוחד ניתוח חלקיקים של צביעת DAPI; עם זאת, בהיעדר יכולת הדמיה פלואורסצנטית, ערכי חיבור PHH ביום 14 מסופקים על תעודות ניתוח ספציפיות ללוט. סף נמוך יגרום לספירה לא מדויקת של חלקיקי DAPI. מומלץ גם לבדוק את שטח הפנים של חלקיקי DAPI בודדים לפני קביעת אי הכללת גודל. ניתן להשיג זאת על-ידי שימוש בסמל הסגלגל [איור 2 (1), סמל העיגול מתחת לכרטיסייה עריכה ] וציור עיגול שמקיף את חלקיק DAPI. לאחר מכן ניתן להשתמש בכרטיסיה ניתוח כדי למדוד את השטח של חלקיק DAPI שנבחר. ניתן לבחור מדידות ספציפיות באמצעות הגדרת מדידות תחת הכרטיסיה ניתוח [שלב 8.9 ואיור 2 (4)].
השיטות הנוכחיות לגידול PHHs כוללות שימוש בציפויים כגון קולגן-I להגברת חיבור התאים במונוקולטורה דו-ממדית מסורתית11 או כיסוי עם מטריצה חוץ-תאית, כמו מטריג'ל מבוסס מורין, טכניקה המכונה בדרך כלל "תרבית סנדוויץ'"12,13,14,15. בעוד שטכניקת תרבית הסנדוויץ' משפרת את המורפולוגיה והקוטביות של PHH לאורך זמן בהשוואה למונוקולטורה מסורתית, שתי הגישות עדיין חסרות יציבות פנוטיפית ארוכת טווח בתרבות עבור רוב סוגי ה-PHH. שיטה נוספת המשמשת לתרבית PHH היא הכנת ספרואידים תלת-ממדיים; עם זאת, כפי שצוין קודם לכן על ידי Glicklis et al.4, יכולים להיות אתגרים טכניים עם שחזור של גודל spheroid עקב השתנות התורם. במאמץ ליצור מודל כבד רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, פותחו מודלים רב-תאיים. כפי שתואר על ידי Ware et al.7, שימוש במיקרו-דפוסים, פיברובלסטים מורינים ותאי אנדותל סינוסואידים ראשוניים של הכבד האנושי המוקפים ב-PHHs אפשרו זמני תרבית מבחנה ארוכים יותר. עם זאת, מיקרו-תבניות יכולות להיות תהליך מורכב וגוזל זמן, ותאי ההזנה שאינם אנושיים עשויים לתרום לרקע באותות מטבוליים, מה שמגביל את התועלת של פלטפורמה זו ביישומים מסוימים. השימוש בתאים שונים שאינם תאי כבד, כולל פיברובלסטים עוריים של בני אדם וחולדות ותאי אנדותל של אבי העורקים של בקר כתאי הזנה לתרבית משותפת של הפטוציטים, הראה הפרשת אלבומין ויצירת צומת הדוקה בדומה לתרביות משותפות של תאי הזנה ממוצא כבד16. עם זאת, מנגנון האינטראקציות בין תאים שאינם מזינים את הכבד TV2D+ לבין PHHs בתרבית צריך להיחקר עוד יותר כדי להבין טוב יותר את ההשפעה על היציבות והפונקציונליות של PHHs במערכת זו. מערכת התרביות שתוארה בעבר על ידי Weaver et al.8 יכולה לגדל בהצלחה PHHs במושבות כבד למשך עד 42 יום, וליצור רשתות תעלות מרה נרחבות. ה-PHHs שגודלו בתרבית במערכת זו שמרו על פונקציונליות מרכזית של הכבד, כולל פעילות Cytochrome 1A2, 2B6 ו-3A4 ופעילות אנזימים מבוססי Uridine 5′-diphospho-glucuronosyltransferase (UGT), יצירת מטבוליטים שלב I ו-II, ייצור אלבומין וסינתזה של אוריאה במשך 22 ימים לפחות במבחנה ללא מטריג'ל. מערכת תרבית זו מייצרת תפוקות יציבות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית הניתנות להתאמה בקלות לכל מעבדה ליישומים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים. למרות שפונקציות PHH מרכזיות נשמרות במערכת TV2D+, לא בוצעו השוואות ישירות למודל הספרואיד התלת-ממדי; עם זאת, עבודה עתידית המשווה את אותם תורמי PHH בין מערכות התרבית תוכיח את עצמה כבעלת ערך בקביעת הגבולות והיתרונות של שתי השיטות.
יישומים פוטנציאליים של TV2D+ כוללים הערכה של פינוי מטבולי ואינטראקציות בין תרופות לתרופות של תרכובות בעלות מחזור נמוך, פגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות והערכת סיכונים של אגרוכימיקלים. חיזוי מדויק של פינוי הכבד של תרופות חדשות ומתפתחות מסתמך על תרבית PHH יציבה וממושכת עם שימור של פונקציונליות הפטוצלולרית מרכזית, דבר מאתגר במיוחד בעת הערכת תרכובות בעלות מחזור נמוך. בנוסף, הערכת סיכונים ורעילות כבד הנגרמת על ידי כימיקלים הם חששות בריאותיים עיקריים, והמודלים הנוכחיים אינם מספקים את היציבות והפונקציונליות לטווח ארוך בתרבית כדי להעריך במדויק רעילות כימית כרונית פוטנציאלית שעשויה להיות משנית לחשיפה חריפה. PHHs בריאים וחולים שגודלו בתרבית TV2D+ הראו הבדלים אופייניים בתפקוד ובנטיית השומנים שנשמרו לאורך זמן17. מחקרים אלה תומכים ב- TV2D+ ככלי מבטיח למגוון יישומים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים.
JO, LW, EG, EL, SP ו-JW הם עובדים של LifeNet Health, הארגון ללא מטרות רווח שמייצר TV2D+.
ברצוננו להודות למליסה קלר וונדי הטמן על עזרתן בסקירת כתבי יד ודיור.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved