JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

تصوير كامل التركيب لتصور وقياس بنية العدسة الطرفية ومورفولوجيا الخلية وتنظيمها

Published: January 19th, 2024

DOI:

10.3791/66017

1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

تصف البروتوكولات الحالية تصويرا جديدا كاملا لتصور الهياكل المحيطية في عدسة العين مع طرق لتحديد كمية الصورة. يمكن استخدام هذه البروتوكولات في الدراسات لفهم العلاقة بين الهياكل المجهرية للعدسة بشكل أفضل وتطوير / وظيفة العدسة.

عدسة العين عبارة عن نسيج مرن شفاف يغير شكله لتركيز الضوء من مسافات مختلفة على شبكية العين. بصرف النظر عن الغشاء القاعدي المحيط بالعضو، والذي يسمى الكبسولة، فإن العدسة خلوية بالكامل وتتكون من طبقة أحادية من الخلايا الطلائية في نصف الكرة الأمامي وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الطلائية في المنطقة الإنباتية عند خط استواء العدسة ، وتهاجر الخلايا الطلائية الاستوائية وتستطيل وتتمايز إلى خلايا ليفية مكونة حديثا. تغير الخلايا الظهارية الاستوائية بشكل كبير التشكل من خلايا معبأة عشوائيا على شكل حجر مرصوف بالحصى إلى خلايا سداسية الشكل تشكل صفوفا زوالية. تحتفظ خلايا ألياف العدسة المشكلة حديثا بشكل الخلية السداسية وتستطيل نحو القطبين الأمامي والخلفي ، وتشكل غلافا جديدا من الخلايا المتراكبة على الأجيال السابقة من الألياف. لا يعرف سوى القليل عن الآليات التي تدفع التشكل الملحوظ للخلايا الظهارية للعدسة إلى خلايا الألياف. لفهم بنية العدسة وتطورها ووظيفتها بشكل أفضل ، تم تطوير بروتوكولات تصوير جديدة لتصوير الهياكل الطرفية باستخدام حوامل كاملة من عدسات العين. هنا ، يتم عرض طرق تحديد سمك الكبسولة ، ومنطقة الخلية الظهارية ، والمنطقة النووية للخلية وشكلها ، وترتيب خلية الصف الزوالي والتعبئة ، وعرض الخلايا الليفية. هذه القياسات ضرورية لتوضيح التغيرات الخلوية التي تحدث أثناء نمو العدسة مدى الحياة وفهم التغييرات التي تحدث مع تقدم العمر أو علم الأمراض.

عدسة العين هي نسيج مرن وشفاف يقع في المنطقة الأمامية من العين يعمل على تركيز الضوء بدقة على شبكية العين. يمكن أن تعزى قدرة العدسة على العمل ، جزئيا ، إلى بنيتها المعقدة وتنظيمها1،2،3،4،5،6. تحيط بالكبسولة أنسجة العدسة ، وهي غشاء قاعدي ضروري للحفاظ على بنية العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية7،8،9. العدسة نفسها خلوية بالكامل ، وتتكون من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية والليفية. ....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم إيواء الفئران في منشأة بجامعة ديلاوير ، ويتم الاحتفاظ بها في بيئة خالية من مسببات الأمراض. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك القتل الرحيم عن طريق استنشاق CO2 ، وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ديلاوير (IACUC).

1. إعدا?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كبسولة العدسة الأمامية ومنطقة الخلايا الظهارية والمنطقة النووية
لتحليل سمك كبسولة العدسة ، قمنا بتلوين كبسولات العدسات ، إما في العدسات الحية أو الثابتة ، باستخدام WGA. حددنا الخلايا الظهارية للعدسة عن طريق تسمية الأغشية باستخدام tdTomato في العدسات الحية (الشكل 2 أ.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تتيح البروتوكولات الموصوفة تصورا عالي الدقة المكانية لهياكل وخلايا العدسات المحيطية في المناطق الأمامية والاستوائية للعدسة. في هذه الدراسة ، تم عرض طرق لتصور الهياكل الطرفية للعدسة باستخدام عدسات سليمة (حية أو ثابتة) حيث يتم الحفاظ على بنية عدسة 3D الشاملة. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت طرق بسي.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون R01 EY032056 إلى CC و R01 EY017724 إلى VMF ، وكذلك المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة بموجب المنحة رقم P20GM139760. تم دعم STI من قبل NIH-NIGMS T32-GM133395 كجزء من برنامج تدريب ما قبل الدكتوراه لواجهة الكيمياء والبيولوجيا ، وجائزة جامعة ديلاوير لعلماء الدراسات العليا.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mm Biopsy PunchAcuderm IncNC9084780
AgaroseApex BioResearch Products20-102GP
Antimycotic/AntibioticCytivaSV30079.01
Bovine Serum Albumin (Fraction V)Prometheus25-529
Delicate task wipesKimwipe
Glass bottomed dish (Fluorodish)World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
Laser scanning confocal Microscope 880Zeiss
MatTek Imaging DishMatTek Life SciencesP35G-1.5-14
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences100503-917
PBSGenClone25-507B
Phenol red-free medium 199Gibco11043023
Rhodamine-PhalloidinThermo Fisher00027
Triton X100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved