Helmonteringsbilleder til visualisering og kvantificering af perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisation

De nuværende protokoller beskriver ny helmonteret billeddannelse til visualisering af perifere strukturer i den okulære linse med metoder til billedkvantificering. Disse protokoller kan bruges i undersøgelser til bedre at forstå forholdet mellem linsemikroskalastrukturer og linseudvikling/funktion.

Den okulære linse er et gennemsigtigt fleksibelt væv, der ændrer sin form for at fokusere lys fra forskellige afstande på nethinden. Bortset fra en kældermembran, der omgiver organet, kaldet kapslen, er linsen helt cellulær bestående af et monolag af epitelceller på den forreste halvkugle og en bulkmasse af linsefiberceller. Gennem hele livet spredes epitelceller i den spirende zone ved linseækvator, og ækvatoriale epitelceller migrerer, forlænger og differentierer sig til nydannede fiberceller. Ækvatoriale epitelceller ændrer væsentligt morfologi fra tilfældigt pakkede brostensformede celler til justerede sekskantformede celler, der danner meridionalrækker. Nydannede linsefiberceller bevarer den sekskantede celleform og forlænges mod de forreste og bageste poler og danner en ny skal af celler, der er overlejret på tidligere generationer af fibre. Lidt er kendt om de mekanismer, der driver den bemærkelsesværdige morfogenese af linseepitelceller til fiberceller. For bedre at forstå linsens struktur, udvikling og funktion er der udviklet nye billeddannelsesprotokoller til afbildning af perifere strukturer ved hjælp af hele monteringer af okulære linser. Her vises metoder til kvantificering af kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekerneområde og form, meridional rækkecellerækkefølge og pakning og fibercellebredder. Disse målinger er afgørende for at belyse de cellulære ændringer, der opstår under livslang linsevækst og forstå de ændringer, der opstår med alder eller patologi.

Den okulære linse er et fleksibelt, gennemsigtigt væv placeret i den forreste del af øjet, der fungerer til finfokus lys på nethinden. Linsens evne til at fungere kan delvis tilskrives dens indviklede arkitektur og organisation 1,2,3,4,5,6. Omkring linsevævet er kapslen, en kældermembran, der er afgørende for at opretholde linsestruktur og biomekaniske egenskaber ^7,8,9. Linsen sel....

Mus er anbragt i University of Delaware dyrefacilitet, opretholdt i et patogenfrit miljø. Alle dyreforsøg, herunder eutanasi ved CO₂ indånding, blev udført i overensstemmelse med godkendte dyreprotokoller af University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Forberedelse og billedbehandling af hele objektivmonteringen

1. Fastgørelse af objektiver til helmonteret billeddannelse
   1. Efter aktiv dødshjælp, enukleatøjne og d.......

Forreste linsekapsel, epitelcelleområde og nukleart område
For at analysere linsekapseltykkelsen farvede vi linsekapsler i enten levende eller faste linser med WGA. Vi identificerede linseepitelceller ved at mærke membraner med tdTomato i levende linser (figur 2A) eller via rhodamin-phalloidinfarvning for F-actin ved cellemembranerne i faste linser (figur 2B). I en ortogonal (XZ) projektion giver farvning til WGA og tdTomato/rhodamin-phall.......

De beskrevne protokoller muliggør visualisering med høj rumlig opløsning af perifere linsestrukturer og celler i linsens forreste og ækvatoriale regioner. I denne undersøgelse blev der vist metoder til visualisering af objektivets perifere strukturer ved hjælp af intakte (levende eller faste) linser, hvor den overordnede 3D-linsearkitektur bevares. Derudover blev der leveret enkle metoder til morfometrisk kvantitativ analyse ved hjælp af offentligt tilgængelig FIJI ImageJ-software. Hele monteringsvisualiserings- .......

Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF samt National Institute of General Medical Sciences under bevillingsnummer P20GM139760. STI blev støttet af NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del af Chemistry-Biology Interface predoctoral træningsprogram og af en University of Delaware Graduate Scholars Award.