Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

De oculaire lens is een transparant flexibel weefsel dat van vorm verandert om licht van verschillende afstanden op het netvlies te focussen. Afgezien van een basaalmembraan rond het orgaan, de capsule genaamd, is de lens volledig cellulair en bestaat de lens uit een monolaag van epitheelcellen op de voorste hemisfeer en een bulkmassa lensvezelcellen. Gedurende het hele leven vermenigvuldigen epitheelcellen zich in de kiemzone bij de lensevenaar, en equatoriale epitheelcellen migreren, verlengen en differentiëren tot nieuw gevormde vezelcellen. Equatoriale epitheelcellen veranderen de morfologie aanzienlijk van willekeurig opeengepakte geplaveide cellen in uitgelijnde zeshoekige cellen die meridionale rijen vormen. Nieuw gevormde lensvezelcellen behouden de zeshoekige celvorm en strekken zich uit naar de voorste en achterste polen, waardoor een nieuwe schil van cellen wordt gevormd die over eerdere generaties vezels wordt gelegd. Er is weinig bekend over de mechanismen die de opmerkelijke morfogenese van lensepitheelcellen naar vezelcellen aansturen. Om de structuur, ontwikkeling en functie van lenzen beter te begrijpen, zijn nieuwe beeldvormingsprotocollen ontwikkeld om perifere structuren in beeld te brengen met behulp van hele vattingen van oculaire lenzen. Hier worden methoden getoond om de dikte van de capsule, het epitheelceloppervlak, het celkerngebied en de vorm, de volgorde en verpakking van meridionale rijcellen en de breedte van de vezelcellen te kwantificeren. Deze metingen zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire veranderingen die optreden tijdens levenslange lensgroei en het begrijpen van de veranderingen die optreden met leeftijd of pathologie.

De ooglens is een flexibel, transparant weefsel aan de voorkant van het oog dat functioneert om licht op het netvlies te focussen. Het vermogen van de lens om te functioneren kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de ingewikkelde architectuur en organisatie 1,2,3,4,5,6. Rondom het lensweefsel bevindt zich het kapsel, een basaalmembraan dat essentieel is voor het behoud van de lensstructuur en biomechanische eigenschappen ^7,8,9

Muizen zijn gehuisvest in de dierenfaciliteit van de Universiteit van Delaware, gehouden in een pathogeenvrije omgeving. Alle dierproeven, inclusief euthanasie door CO₂ -inhalatie, werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde dierprotocollen door de University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding en beeldvorming van de gehele lensvatting

1. Fixatie van lenzen voor beeldvorming op de hele vatting
   1. Na .......

Voorste lenskapsel, epitheelcelgebied en nucleair gebied
Om de dikte van het lenskapsel te analyseren, hebben we lenscapsules, in levende of vaste lenzen, gekleurd met WGA. We identificeerden lensepitheelcellen door membranen te labelen met tdTomato in levende lenzen (Figuur 2A), of via rhodamine-phalloidinekleuring voor F-actine op de celmembranen in vaste lenzen (Figuur 2B). In een orthogonale (XZ) projectie stelt kleuring voor WGA en tdTom.......

De beschreven protocollen maken visualisatie met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk van perifere lensstructuren en cellen in de voorste en equatoriale regio's van de lens. In deze studie werden methoden getoond voor de visualisatie van perifere lensstructuren met behulp van intacte (onder spanning staande of vaste) lenzen waarbij de algehele 3D-lensarchitectuur behouden blijft. Daarnaast werden eenvoudige methoden voor morfometrische kwantitatieve analyse met behulp van openbaar beschikbare FIJI ImageJ-software aangebod.......

Dit werk werd ondersteund door de National Eye Institute Grant R01 EY032056 aan CC en R01 EY017724 aan VMF, evenals het National Institute of General Medical Sciences onder subsidienummer P20GM139760. STI werd ondersteund door NIH-NIGMS T32-GM133395 als onderdeel van het predoctorale opleidingsprogramma Chemistry-Biology Interface, en door een University of Delaware Graduate Scholars Award.