Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

Die Okularlinse ist ein transparentes, flexibles Gewebe, das seine Form ändert, um Licht aus verschiedenen Entfernungen auf die Netzhaut zu fokussieren. Abgesehen von einer Basalmembran, die das Organ umgibt, der sogenannten Kapsel, ist die Linse vollständig zellulär und besteht aus einer Monoschicht von Epithelzellen auf der vorderen Hemisphäre und einer Masse von Linsenfaserzellen. Im Laufe des Lebens vermehren sich Epithelzellen in der Keimzone am Linsenäquator, und äquatoriale Epithelzellen wandern, verlängern und differenzieren sich zu neu gebildeten Faserzellen. Äquatoriale Epithelzellen verändern die Morphologie von zufällig gepackten Pflastersteinzellen in ausgerichtete sechseckige Zellen, die meridionale Reihen bilden. Neu gebildete Linsenfaserzellen behalten die hexagonale Zellform bei und verlängern sich zum vorderen und hinteren Pol hin, wodurch eine neue Hülle aus Zellen gebildet wird, die über frühere Generationen von Fasern gelegt werden. Über die Mechanismen, die die bemerkenswerte Morphogenese von Linsenepithelzellen zu Faserzellen antreiben, ist wenig bekannt. Um die Struktur, Entwicklung und Funktion von Linsen besser zu verstehen, wurden neue Bildgebungsprotokolle entwickelt, mit denen periphere Strukturen mit ganzen Okularlinsenfassungen abgebildet werden können. Hier werden Methoden zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Epithelzellfläche, der Zellkernfläche und -form, der meridionalen Reihenzellreihenreihung und -packung sowie der Faserzellbreiten gezeigt. Diese Messungen sind unerlässlich, um die zellulären Veränderungen aufzuklären, die während des lebenslangen Linsenwachstums auftreten, und um die Veränderungen zu verstehen, die mit dem Alter oder der Pathologie auftreten.

Die Okularlinse ist ein flexibles, transparentes Gewebe im vorderen Bereich des Auges, das Licht fein auf die Netzhaut fokussiert. Die Funktionsfähigkeit des Objektivs kann zum Teil auf seine komplizierte Architektur und Organisation zurückgeführt werden 1,2,3,4,5,6. Um das Linsengewebe herum befindet sich die Kapsel, eine Basalmembran, die für die Aufrechterhaltung der Linsenstruktur und der biomechanischen Eigenschaften unerlässlich^ist ....

Die Mäuse werden in der Tiereinrichtung der University of Delaware untergebracht und in einer pathogenfreien Umgebung gehalten. Alle Tierbehandlungen, einschließlich der Euthanasie durch CO_{2 -} Inhalation, wurden in Übereinstimmung mit den vom University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierprotokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung und Bildgebung des gesamten Objektivbajonetts

1. Fixierung von Objektiven für die .......

Vordere Linsenkapsel, Epithelzellbereich und Kernbereich
Um die Dicke der Linsenkapsel zu analysieren, färbten wir Linsenkapseln entweder in lebenden oder festen Linsen mit WGA. Wir identifizierten Linsenepithelzellen durch Markierung von Membranen mit tdTomato in lebenden Linsen (Abbildung 2A) oder durch Rhodamin-Phalloidin-Färbung für F-Aktin an den Zellmembranen in fixierten Linsen (Abbildung 2B). In einer orthogonalen (XZ) Projektion e.......

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen eine hochauflösende Visualisierung von peripheren Linsenstrukturen und -zellen im vorderen und äquatorialen Bereich der Linse. In dieser Studie wurden Methoden zur Visualisierung von Linsenperipheriestrukturen mit intakten (lebenden oder festsitzenden) Linsen gezeigt, bei denen die gesamte 3D-Linsenarchitektur erhalten bleibt. Darüber hinaus wurden einfache Methoden zur morphometrischen quantitativen Analyse mit der öffentlich zugänglichen Software FIJI ImageJ bereitgestellt.......

Diese Arbeit wurde durch den National Eye Institute Grant R01 EY032056 an CC und R01 EY017724 an VMF sowie durch das National Institute of General Medical Sciences unter der Fördernummer P20GM139760 unterstützt. S.T.I wurde von NIH-NIGMS T32-GM133395 im Rahmen des Chemistry-Biology Interface Predoctoral Training Program und von einem University of Delaware Graduate Scholars Award unterstützt.