Helmonteringsavbildning for å visualisere og kvantifisere perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisasjon

De foreliggende protokollene beskriver ny helmonteringsavbildning for visualisering av perifere strukturer i okularlinsen med metoder for bildekvantifisering. Disse protokollene kan brukes i studier for å bedre forstå forholdet mellom linsemikroskalastrukturer og linsens utvikling/funksjon.

Den okulære linsen er et gjennomsiktig, fleksibelt vev som endrer form for å fokusere lys fra forskjellige avstander på netthinnen. Bortsett fra en kjellermembran som omgir orgelet, kalt kapselen, er linsen helt cellulær bestående av et monolag av epitelceller på den fremre halvkule og en bulkmasse av linsefiberceller. Gjennom livet prolifererer epitelceller i den spirende sonen ved linseekvator, og ekvatoriale epitelceller migrerer, forlenger og differensierer til nydannede fiberceller. Ekvatoriale epitelceller endrer vesentlig morfologi fra tilfeldig pakkede brosteinformede celler til justerte sekskantformede celler som danner meridionale rader. Nydannede linsefiberceller beholder den sekskantede celleformen og strekker seg mot de fremre og bakre polene, og danner et nytt skall av celler som er lagt på tidligere generasjoner av fibre. Lite er kjent om mekanismene som driver den bemerkelsesverdige morfogenesen av linseepitelceller til fiberceller. For bedre å forstå linsestruktur, utvikling og funksjon, har nye bildebehandlingsprotokoller blitt utviklet for å avbilde perifere strukturer ved hjelp av hele monteringer av okulære linser. Her vises metoder for å kvantifisere kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekjerneområde og form, meridional radcelleorden og pakking, og fibercellebredder. Disse målingene er avgjørende for å belyse de cellulære endringene som skjer under livslang linsevekst og forstå endringene som skjer med alder eller patologi.

Den okulære linsen er et fleksibelt, gjennomsiktig vev som ligger i den fremre delen av øyet som fungerer for å finfokusere lys på netthinnen. Linsens evne til å fungere kan delvis tilskrives dens intrikate arkitektur og organisasjon 1,2,3,4,5,6. Rundt linsevevet er kapselen, en kjellermembran som er avgjørende for å opprettholde linsestruktur og biomekaniske egenskaper ^7,8,9. Lin....

Mus er plassert i University of Delaware dyreavdeling, opprettholdt i et patogenfritt miljø. Alle dyreprosedyrer, inkludert eutanasi ved CO₂ -innånding, ble utført i samsvar med godkjente dyreprotokoller fra University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Klargjøring og avbildning av hele objektivfatningen

1. Fiksering av linser for bildebehandling med hele fatningen
   1. Etter eutanasi, enucleate øyne og dissekere linser.......

Fremre linsekapsel, epitelcelleområde og nukleært område
For å analysere linsekapseltykkelsen farget vi linsekapsler, enten i levende eller faste linser, med WGA. Vi identifiserte linseepitelceller ved å merke membraner med tdTomato i levende linser (figur 2A), eller via rhodamin-falloidinfarging for F-aktin ved cellemembranene i faste linser (figur 2B). I en ortogonal (XZ) projeksjon lar farging for WGA og tdTomat / rhodamin-falloidin o.......

De beskrevne protokollene muliggjør visualisering av høy romlig oppløsning av perifere linsestrukturer og celler i linsens fremre og ekvatoriale regioner. I denne studien ble det vist metoder for visualisering av linsens perifere strukturer ved bruk av intakte (levende eller faste) linser der den generelle 3D-linsearkitekturen er bevart. I tillegg ble enkle metoder for morfometrisk kvantitativ analyse ved hjelp av offentlig tilgjengelig FIJI ImageJ-programvare gitt. Hele monteringsvisualiserings- og kvantifiseringsmet.......

Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under tilskuddsnummer P20GM139760. STI ble støttet av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoctoral training program, og av en University of Delaware Graduate Scholars Award.