Helmonterad avbildning för att visualisera och kvantifiera perifer linsstruktur, cellmorfologi och organisation

De aktuella protokollen beskriver nya helfattningsavbildningar för visualisering av perifera strukturer i den okulära linsen med metoder för bildkvantifiering. Dessa protokoll kan användas i studier för att bättre förstå förhållandet mellan linsstrukturer i mikroskala och linsutveckling/funktion.

Ögonlinsen är en genomskinlig flexibel vävnad som ändrar sin form för att fokusera ljus från olika avstånd på näthinnan. Bortsett från ett basalmembran som omger organet, kallat kapseln, är linsen helt cellulär och består av ett monolager av epitelceller på den främre halvklotet och en bulkmassa av linsfiberceller. Under hela livet förökar sig epitelceller i den groende zonen vid linsens ekvator, och ekvatoriella epitelceller migrerar, förlängs och differentieras till nybildade fiberceller. Ekvatoriella epitelceller förändrar väsentligt morfologin från slumpmässigt packade kullerstensformade celler till inriktade hexagonformade celler som bildar meridionala rader. Nybildade linsfiberceller behåller den sexkantiga cellformen och förlängs mot de främre och bakre polerna och bildar ett nytt skal av celler som läggs ovanpå tidigare generationer av fibrer. Lite är känt om de mekanismer som driver den anmärkningsvärda morfogenesen av linsepitelceller till fiberceller. För att bättre förstå linsens struktur, utveckling och funktion har nya avbildningsprotokoll utvecklats för att avbilda perifera strukturer med hjälp av hela fästen av okulära linser. Här visas metoder för att kvantifiera kapseltjocklek, epitelcellarea, cellkärnarea och form, meridional radcellordning och packning samt fibercellbredder. Dessa mätningar är viktiga för att belysa de cellulära förändringar som uppstår under livslång linstillväxt och förstå de förändringar som uppstår med ålder eller patologi.

Den okulära linsen är en flexibel, genomskinlig vävnad som ligger i ögats främre region och som fungerar för att finfokusera ljuset på näthinnan. Linsens förmåga att fungera kan delvis tillskrivas dess intrikata arkitektur och organisation 1,2,3,4,5,6. Runt linsvävnaden finns kapseln, ett basalmembran som är nödvändigt för att upprätthålla linsens struktur och biomekaniska egenskaper ^7,8,9

Möss hålls i University of Delawares djuranläggning, som hålls i en patogenfri miljö. Alla djurförsök, inklusive avlivning genom inandning av CO₂ , utfördes i enlighet med godkända djurprotokoll från University of Delaware Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Förberedelse och avbildning av hela objektivfattningen

1. Fixering av objektiv för helfattningsavbildning
   1. Efter eutanasi ska ögon och dissekeras som tidigare beskri.......

Främre linskapsel, epitelcellområde och kärnområde
För att analysera linskapselns tjocklek färgade vi linskapslar, antingen i levande eller fasta linser, med WGA. Vi identifierade linsepitelceller genom att märka membran med tdTomat i levande linser (Figur 2A), eller via rodamin-falloidinfärgning för F-aktin vid cellmembranen i fasta linser (Figur 2B). I en ortogonal (XZ) projektion gör färgning för WGA och tdTomato/rhodamin-fallo.......

De beskrivna protokollen möjliggör visualisering med hög rumslig upplösning av perifera linsstrukturer och celler vid linsens främre och ekvatoriella regioner. I denna studie visades metoder för visualisering av perifera strukturer med hjälp av intakta (levande eller fasta) linser där den övergripande 3D-linsarkitekturen bevaras. Dessutom tillhandahölls enkla metoder för morfometrisk kvantitativ analys med hjälp av offentligt tillgänglig FIJI ImageJ-programvara. Hela monteringsvisualiserings- och kvantifieri.......

Detta arbete stöddes av National Eye Institute Grant R01 EY032056 till CC och R01 EY017724 till VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under anslagsnummer P20GM139760. STI stöddes av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoktorala utbildningsprogram och av ett University of Delaware Graduate Scholars Award.