Одноэтапное выделение внеклеточных везикул из образцов большого объема с помощью раздвоенного микрофлюидного устройства A4F

Summary

Внеклеточные везикулы имеют огромные перспективы для биомедицинских применений, но современные методы выделения отнимают много времени и непрактичны для клинического использования. В этом исследовании мы представляем микрофлюидное устройство, которое позволяет напрямую выделять внеклеточные везикулы из больших объемов биожидкостей в непрерывном режиме с минимальными шагами.

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) обладают огромным потенциалом для различных биомедицинских применений, включая диагностику, доставку лекарств и регенеративную медицину. Тем не менее, существующие методики изоляции электромобилей представляют собой значительные проблемы, такие как сложность, затраты времени и необходимость громоздкого оборудования, что затрудняет их клиническую трансляцию. Чтобы устранить эти ограничения, мы стремились разработать инновационную микрофлюидную систему на основе тиол-ена с циклическим сополимером олефинов вне стехиометрии (COC-OSTE) для эффективной изоляции ВВ из образцов большого объема в непрерывном режиме. Используя разделение на основе размера и плавучести, технология, использованная в этом исследовании, позволила добиться значительно более узкого распределения по размерам по сравнению с существующими подходами на основе образцов мочи и клеточных сред, что позволило нацеливаться на конкретные размерные фракции EV в будущих приложениях. Наша инновационная конструкция микрофлюидного устройства COC-OSTE, использующая технологию фракционирования с раздвоением асимметричного потока в поле, предлагает простой и непрерывный подход к изоляции EV для образцов большого объема. Кроме того, потенциал для массового производства этого микрофлюидного устройства обеспечивает масштабируемость и согласованность, что делает возможным интеграцию изоляции электромобилей в рутинную клиническую диагностику и промышленные процессы, где высокая согласованность и пропускная способность являются важными требованиями.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой клеточные мембраносвязанные частицы, состоящие из двух основных типов: экзосомы (30-200 нм) и микровезикулы (200-1000 нм)¹. Экзосомы образуются путем почкования эндосомальной мембраны внутрь в мультивезикулярном теле (МВБ), высвобождая внутрипросветные везикулы (РКН) во внеклеточное пространство при слиянии с плазматической мембраной¹. Напротив, микровезикулы образуются в результате почкования наружу и деления клеточной мембраны². ВВ играют решающую роль в межклеточной коммуникации, транспортируя белки, нуклеиновые кислоты, липиды и метаболиты, отражая....

Protocol

Отбор проб был одобрен Комиссией по этике исследований в области жизни и медицины Латвийского университета (решение N0-71-35/54)

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, использованные в этом исследовании, включены в файл Table of Materials .

1. Изготовление трехмерных (3D) печ.......

Discussion

Представленное микрофлюидное устройство предлагает многообещающий метод выделения и экстракции электромобилей из биологических жидкостей, устраняя некоторые критические ограничения существующих методов золотого стандарта, таких как UC и SEC¹². UC и SEC, как известно, трудоем.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes	Starstedt	72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle	RAYS	TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes	Eppendorf	30108132
20 mL syringes	BD PlastikPak	10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units	Merck Millipore,	UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding	Greiner Bio-One	655001	ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform	Microfluidic Chipshop	10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer	Microfluidic Chipshop	10000387
Elveflow OB1 pressure controller	Elvesys Group
Luer connectors	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	nanoparticle analyzer
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column	Izon	SP5	SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit	PP&S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	331301
Syringe pump	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension flask	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc protein	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Horseradish peroxidase substrate
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek instruments	71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		dynamic light scattering (DLS) system
Zortrax Inkspire	Zortrax