Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Внеклеточные везикулы имеют огромные перспективы для биомедицинских применений, но современные методы выделения отнимают много времени и непрактичны для клинического использования. В этом исследовании мы представляем микрофлюидное устройство, которое позволяет напрямую выделять внеклеточные везикулы из больших объемов биожидкостей в непрерывном режиме с минимальными шагами.

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) обладают огромным потенциалом для различных биомедицинских применений, включая диагностику, доставку лекарств и регенеративную медицину. Тем не менее, существующие методики изоляции электромобилей представляют собой значительные проблемы, такие как сложность, затраты времени и необходимость громоздкого оборудования, что затрудняет их клиническую трансляцию. Чтобы устранить эти ограничения, мы стремились разработать инновационную микрофлюидную систему на основе тиол-ена с циклическим сополимером олефинов вне стехиометрии (COC-OSTE) для эффективной изоляции ВВ из образцов большого объема в непрерывном режиме. Используя разделение на основе размера и плавучести, технология, использованная в этом исследовании, позволила добиться значительно более узкого распределения по размерам по сравнению с существующими подходами на основе образцов мочи и клеточных сред, что позволило нацеливаться на конкретные размерные фракции EV в будущих приложениях. Наша инновационная конструкция микрофлюидного устройства COC-OSTE, использующая технологию фракционирования с раздвоением асимметричного потока в поле, предлагает простой и непрерывный подход к изоляции EV для образцов большого объема. Кроме того, потенциал для массового производства этого микрофлюидного устройства обеспечивает масштабируемость и согласованность, что делает возможным интеграцию изоляции электромобилей в рутинную клиническую диагностику и промышленные процессы, где высокая согласованность и пропускная способность являются важными требованиями.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой клеточные мембраносвязанные частицы, состоящие из двух основных типов: экзосомы (30-200 нм) и микровезикулы (200-1000 нм)1. Экзосомы образуются путем почкования эндосомальной мембраны внутрь в мультивезикулярном теле (МВБ), высвобождая внутрипросветные везикулы (РКН) во внеклеточное пространство при слиянии с плазматической мембраной1. Напротив, микровезикулы образуются в результате почкования наружу и деления клеточной мембраны2. ВВ играют решающую роль в межклеточной коммуникации, транспортируя белки, нуклеиновые кислоты, липиды и метаболиты, отражая....

Protocol

Отбор проб был одобрен Комиссией по этике исследований в области жизни и медицины Латвийского университета (решение N0-71-35/54)

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, использованные в этом исследовании, включены в файл Table of Materials .

1. Изготовление трехмерных (3D) печ.......

Representative Results

Мы изготовили микрофлюидное устройство с использованием напечатанной на 3D-принтере пресс-формы с двойным негативом (рис. 1) с помощью мягкой литографии (рис. 2A) для высокопроизводительного разделения EV на основе принципа раздвоения A4F (рис. 2B

Discussion

Представленное микрофлюидное устройство предлагает многообещающий метод выделения и экстракции электромобилей из биологических жидкостей, устраняя некоторые критические ограничения существующих методов золотого стандарта, таких как UC и SEC12. UC и SEC, как известно, трудоем.......

Acknowledgements

Благодарим всех доноров, принявших участие в этом исследовании, сотрудников Латвийской геномной базы данных за предоставленные образцы. Институт физики твердого тела Латвийского университета в качестве Центра передового опыта получил финансирование в рамках рамочной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 в рамках грантового договора No 739508, проект CAMART2. Работа выполнена при поддержке Латвийского совета по науке Проект No. lzp-2019/1-0142 и номер проекта: lzp-2022/1-0373.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm carboxylate FluoSpheresInvitrogen#F8803Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubesStarstedt72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needleRAYSTUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheresInvitrogen#F13083Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettesSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filtersMerck MilliporeUFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubesEppendorf30108132
20 mL syringesBD PlastikPak10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubingDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter unitsMerck Millipore,UFC200324
5 mL Medical Syringe without NeedleAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 mL conical tubesSarstedt62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotorBeckman Coulter337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubingDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. bindingGreiner Bio-One655001ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Bovine serum albuminSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas microscopy slide platformMicrofluidic Chipshop10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer Microfluidic Chipshop10000387
Elveflow OB1 pressure controllerElvesys Group
Luer connectorsDarwin Microfluidics CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 gFisher ScientificBP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterileSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm columnIzonSP5SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer KitPP&S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotorBeckman Coulter331301
Syringe pumpDK InfusetekISPLab002
T175 suspension flaskSarstedt83.3912.502
TIM4-Fc proteinAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)SigmaAldrichT0440-100MLHorseradish peroxidase substrate
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XPBeckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate SpectrophotometerBio-Tek instruments71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterileAPTACA2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe FilterSigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalyticaldynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax InkspireZortrax

References

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis ....

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved