ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית

Summary

פרוטוקול זה נועד להעריך פפטידים ביו-פונקציונליים להרכבה עצמית עבור הידבקות תאים, מורפולוגיה אורגנואידית וביטוי גנים על ידי אימונוסטיין. אנו נשתמש בקו תאי סרטן המעי הגס כדי לספק דרך חסכונית להשגת אורגנואידים לבדיקות אינטנסיביות.

Abstract

פפטידים אולטרה-קצרים להרכבה עצמית (SAPs) יכולים ליצור באופן ספונטני ננו-סיבים הדומים למטריצה חוץ-תאית. סיבים אלה מאפשרים היווצרות של הידרוג'לים תואמים ביולוגית, מתכלים ולא אימונוגניים. הוכחנו בעבר כי SAPs, כאשר הם מתפקדים ביולוגית עם מוטיבים שמקורם בחלבון, יכולים לחקות את מאפייני המטריצה החוץ תאיים התומכים בהיווצרות אורגנואידים במעי הגס. הידרוג'לים פפטידים ביו-פונקציונליים אלה שומרים על התכונות המכניות, יכולת הכוונון ויכולת ההדפסה של פפטיד האב המקורי תוך שילוב רמזים המאפשרים אינטראקציות בין מטריצת התא להגביר את הידבקות התא. מאמר זה מציג את הפרוטוקולים הדרושים כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של הידרוג'לים פפטידים ביו-פונקציונליים שונים על הידבקות תאים והיווצרות לומן באמצעות קו תאים סרטני אדנוקרצינומה המסוגל ליצור אורגנואידים של סרטן המעי הגס בצורה חסכונית. פרוטוקולים אלה יסייעו להעריך את ההשפעות של פפטיד הידרוג'ל ביו-פונקציונלי על הידבקות תאים והיווצרות לומינלית באמצעות צביעה חיסונית וניתוח תמונה פלואורסצנטית. קו התאים ששימש במחקר זה שימש בעבר לייצור אורגנואידים במטריצות שמקורן בבעלי חיים.

Introduction

בשנים האחרונות, פפטידים להרכבה עצמית (SAPs) התגלו כביו-חומרים מבטיחים ליישומי הנדסת רקמות. ל-SAPs תכונות ייחודיות, כולל היווצרות ספונטנית של ננו-סיבים, תאימות ביולוגית, מתכלות ביולוגית ואי-אימונוגניות, מה שהופך אותם למועמדים אטרקטיביים לפיתוח פיגומים¹. SAPs שימשו בעבר יחד עם סוגים שונים של תאים, ובעיקר, SAPs אולטרה קצרים דווחו הקלו על אנקפסולציה של תאי גזע תוך שמירה על פלוריפוטנטיות שלהם לאורך תקופות ממושכות הכוללות יותר מ -30 מעברים עם שכיחות מינימלית של סטיות כרומוזומליות ^2,3,4. לפיכך, התאמת SAPs לשימוש בהם בתרבות אורגנואידים הי....

Protocol

1. חיץ והכנת תמיסה

הערה: כל הריכוזים המוצהרים הם ריכוזים סופיים.

1. הוסף סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין בריכוז סופי של 10% ו -1%, בהתאמה, כדי להכין את המדיום של Dulbecco של Iscove שונה (IMDM). יש לאחסן בחושך ב-4°C למשך עד חודש אחד.
2. ערבבו את MgCl₂ (3 מילימול), סוכרו?.......

Discussion

הפוטנציאל העצום של SAPs במחקר ביו-רפואי מודגש על ידי הגמישות ויכולת ההסתגלות שלהם באמצעות ביו-פונקציונליזציה. עם מערך כה נרחב של תמורות, האתגר מתעורר בבדיקה יעילה ובקביעת התצורות המבטיחות ביותר עבור יישומים ספציפיים, במיוחד במחקר אורגנואידים. פתרון מהיר וחסכוני הוא בעל חשיבות עליונה. קו הת.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015