A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол направлен на оценку биофункциональных самоорганизующихся пептидов на предмет клеточной адгезии, морфологии органоидов и экспрессии генов путем иммуноокрашивания. Мы будем использовать клеточную линию колоректального рака, чтобы обеспечить экономически эффективный способ получения органоидов для интенсивного тестирования.
Ультракороткие самоорганизующиеся пептиды (САП) могут спонтанно образовывать нановолокна, напоминающие внеклеточный матрикс. Эти волокна позволяют образовывать гидрогели, которые являются биосовместимыми, биоразлагаемыми и неиммуногенными. Ранее мы доказали, что САП, будучи биофункционализированными с помощью белковых мотивов, могут имитировать характеристики внеклеточного матрикса, которые поддерживают формирование колоректальных органоидов. Эти биофункциональные пептидные гидрогели сохраняют механические свойства исходного родительского пептида, его настраиваемость и печатаемость, при этом они включают сигналы, которые позволяют клеточно-матриксным взаимодействиям увеличивать клеточную адгезию. В данной статье представлены протоколы, необходимые для оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидных гидрогелей на адгезию клеток и формирование просвета с использованием клеточной линии аденокарциномы рака, способной экономически эффективно образовывать органоиды колоректального рака. Эти протоколы помогут оценить влияние биофункционального пептидного гидрогеля на клеточную адгезию и образование люминалей с помощью иммуноокрашивания и анализа флуоресцентного изображения. Клеточная линия, используемая в этом исследовании, ранее использовалась для генерации органоидов в матрицах животного происхождения.
В последние годы самоорганизующиеся пептиды (САП) стали перспективными биоматериалами для применения в тканевой инженерии. САП обладают уникальными свойствами, включая спонтанное образование нановолокон, биосовместимость, биоразлагаемость и неиммуногенность, что делает их привлекательными кандидатамидля разработки скаффолда. САП ранее использовались вместе с различными типами клеток, и, в частности, сообщалось, что ультракороткие САП способствовали инкапсуляции стволовых клеток, сохраняя их плюрипотентность в течение длительных периодов, охватывающих более 30 пассажей, и с минимальной частотой хромосомных аберраций
1. Приготовление буфера и раствора
ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные концентрации являются конечными концентрациями.
Во-первых, мы оценили клетки, выращенные в 24-луночном планшете в течение 7 дней с помощью визуализации в светлом поле. Мы идентифицировали небольшие кластеры клеток, собирающихся в органоиды в течение недели, как показано на рисунке 4. Метод контролируемого сканирования ?.......
Огромный потенциал САП в биомедицинских исследованиях подчеркивается их податливостью и адаптивностью за счет биофункционализации. При таком обширном спектре перестановок возникает проблема эффективного тестирования и определения наиболее перспективных конфигураций для конкретн.......
Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Научно-технологического университета имени короля Абдаллы. Авторы выражают признательность гранту Посевного фонда KAUST и Инновационному фонду KAUST, присужденным Отделом инноваций и экономического развития KAUST. Авторы выражают признательность основным лабораториям бионауки и визуализации KAUST за поддержку в проведении биологических характеристик и микроскопических анализов.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x PBS | Gibco | 14190144 | |
6-well plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-83 | |
10x PBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 70011044 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | |
24-well plate, tissue culture treated | Corning | 09-761-146 | |
96-well black plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-565 | |
alamarBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1025 | |
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab40839 | Secondary used: anti-rabbit Dylight 633 |
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab16505 | Secondary used: anti-rabbit Alexa 488 |
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal | Abcam | ab190085 | Secondary used: anti-goat Alexa 488 |
BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cellpose 2.0 | NA | NA | Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose |
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan | ZEISS | LSM 880 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11055 | |
Glycine | Cytiva | GE17-1323-01 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633 | Invitrogen | 35562 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS) | Gibco | 16140071 | |
ImageJ 1.54f | NIH | NA | |
IMDM | Gibco | 12440079 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free | Corning | 356255 | Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix. |
Microscope, brightfield | |||
Microscope, EVOS | Thermo Scientific | EVOS M7000 | |
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154 | OriginLab Corp | NA | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Round Cover Slip, 10 mm diameter | VWR | 631-0170 | |
Scanning Electron Microscope | Thermo Fisher - FEI | TENEO VS | |
Sterile 30 μm strainer | Sysmex | 04-004-2326 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | |
SW1222 cell line | ECACC | 12022910 | |
Triton x-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977015 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved