Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол направлен на оценку биофункциональных самоорганизующихся пептидов на предмет клеточной адгезии, морфологии органоидов и экспрессии генов путем иммуноокрашивания. Мы будем использовать клеточную линию колоректального рака, чтобы обеспечить экономически эффективный способ получения органоидов для интенсивного тестирования.

Abstract

Ультракороткие самоорганизующиеся пептиды (САП) могут спонтанно образовывать нановолокна, напоминающие внеклеточный матрикс. Эти волокна позволяют образовывать гидрогели, которые являются биосовместимыми, биоразлагаемыми и неиммуногенными. Ранее мы доказали, что САП, будучи биофункционализированными с помощью белковых мотивов, могут имитировать характеристики внеклеточного матрикса, которые поддерживают формирование колоректальных органоидов. Эти биофункциональные пептидные гидрогели сохраняют механические свойства исходного родительского пептида, его настраиваемость и печатаемость, при этом они включают сигналы, которые позволяют клеточно-матриксным взаимодействиям увеличивать клеточную адгезию. В данной статье представлены протоколы, необходимые для оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидных гидрогелей на адгезию клеток и формирование просвета с использованием клеточной линии аденокарциномы рака, способной экономически эффективно образовывать органоиды колоректального рака. Эти протоколы помогут оценить влияние биофункционального пептидного гидрогеля на клеточную адгезию и образование люминалей с помощью иммуноокрашивания и анализа флуоресцентного изображения. Клеточная линия, используемая в этом исследовании, ранее использовалась для генерации органоидов в матрицах животного происхождения.

Introduction

В последние годы самоорганизующиеся пептиды (САП) стали перспективными биоматериалами для применения в тканевой инженерии. САП обладают уникальными свойствами, включая спонтанное образование нановолокон, биосовместимость, биоразлагаемость и неиммуногенность, что делает их привлекательными кандидатамидля разработки скаффолда. САП ранее использовались вместе с различными типами клеток, и, в частности, сообщалось, что ультракороткие САП способствовали инкапсуляции стволовых клеток, сохраняя их плюрипотентность в течение длительных периодов, охватывающих более 30 пассажей, и с минимальной частотой хромосомных аберраций

Protocol

1. Приготовление буфера и раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные концентрации являются конечными концентрациями.

  1. Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин-стрептомицин в конечной концентрации 10% и 1% соответственно, чтобы получить полную модифициров.......

Representative Results

Во-первых, мы оценили клетки, выращенные в 24-луночном планшете в течение 7 дней с помощью визуализации в светлом поле. Мы идентифицировали небольшие кластеры клеток, собирающихся в органоиды в течение недели, как показано на рисунке 4. Метод контролируемого сканирования ?.......

Discussion

Огромный потенциал САП в биомедицинских исследованиях подчеркивается их податливостью и адаптивностью за счет биофункционализации. При таком обширном спектре перестановок возникает проблема эффективного тестирования и определения наиболее перспективных конфигураций для конкретн.......

Acknowledgements

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Научно-технологического университета имени короля Абдаллы. Авторы выражают признательность гранту Посевного фонда KAUST и Инновационному фонду KAUST, присужденным Отделом инноваций и экономического развития KAUST. Авторы выражают признательность основным лабораториям бионауки и визуализации KAUST за поддержку в проведении биологических характеристик и микроскопических анализов.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco14190144
6-well plate, tissue culture treatedCorning07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesiumGibco70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906
24-well plate, tissue culture treatedCorning09-761-146
96-well black plate, tissue culture treatedCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonalAbcamab40839Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonalAbcamab16505Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonalAbcamab190085Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633Invitrogen35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red freeCorning356255Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, 10 mm diameterVWR631-0170
Scanning Electron MicroscopeThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μm strainerSysmex04-004-2326
sucroseSigma-AldrichS1888
SW1222 cell lineECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure waterInvitrogen10977015

References

Explore More Articles

SW1222

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved