Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.

Abstract

מאמר פרוטוקול זה נועד לספק לחוקרים החדשים את הפרטים המלאים של השימוש ב- Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) כדי ליצור פרופיל של המיקומים הגנומיים של גורמים קושרי כרומטין, סימני היסטון ווריאנטים של היסטון. פרוטוקולי CUT&Tag מתפקדים היטב עם מיובלסטים של עכברים ותאי גזע שריריים שזה עתה בודדו (MuSCs). הם יכולים בקלות להיות מיושמים על סוגי תאים רבים אחרים כל עוד התאים יכולים להיות משותקים על ידי חרוזי Concanavalin-A. בהשוואה ל- CUT&Tag, מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) הם ניסויים הגוזלים זמן. בדיקות ChIP דורשות טיפול מקדים בכרומטין לפני שניתן יהיה להשתמש בחומר הכרומטי עבור משקעים חיסוניים. ב- cross-linking ChIP (X-ChIP), טיפול מקדים בכרומטין כולל קישור צולב וסוניקציה כדי לשבור את הכרומטין. במקרה של ChIP מקורי (N-ChIP), הכרומטין המקוטע מושג בדרך כלל על ידי עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase). הן סוניקציה והן עיכול MNase מציגים הטיה מסוימת לניסויי ChIP. בדיקות CUT&Tag יכולות להסתיים תוך פחות שלבים ודורשות הרבה פחות תאים בהשוואה ל- ChIPs אך מספקות מידע בלתי משוחד יותר על גורמי שעתוק או סימני היסטון במיקומים גנומיים שונים. CUT&Tag יכול לתפקד עם עד 5,000 תאים בלבד. בשל רגישותו הגבוהה יותר ואות הרקע הנמוך יותר מאשר ChIPs, החוקרים יכולים לצפות לקבל נתוני שיא אמינים רק מכמה מיליוני קריאות לאחר ריצוף.

Introduction

בדיקת CUT&Tag הומצאה כדי לפצות על כמה פגמים גלויים של ChIPs1. שני החסרונות העיקריים של ChIPs הם 1) ההטיה המוצגת בעת פיצול כרומטין 2) חוסר היכולת לעבוד עם מספרי תאים נמוכים. מבחני X-ChIP מסתמכים על סוניקציה או על עיכול MNase כדי לקבל מקטעי כרומטין, בעוד N-ChIP משתמש בעיקר בעיכול MNase כדי לקבל נוקלאוזומים. סוניקציה מראה הטיה לכיוון מיקומי כרומטין רגועים כגון אזורי מקדם2, וככל הנראה, עיכול MNase עובד ביעילות רבה יותר גם על סיבי כרומטין רגועים. יתר על כן, חלקם דיווחו כי עיכול MNase מראה גם הטיה תלוית רצף DNA3. לכן, בשלב הכנת הקלט של בדיקות ChIP, אי אפשר לקבל קטעי כרומטין מכל מיני מיקומים גנומיים באופ....

Protocol

השיטות המוצגות בכתב יד זה מאושרות כולן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו. עכברים ששימשו ליצירת התוצאות המייצגות של כתב היד הזה שוכנו ותוחזקו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו.

1. בידוד מיובלסט משרירי הג.......

Representative Results

לפני קשירת תאים לחרוזי Concanavalin-A, בדוק את תרחיף התא מתחת למיקרוסקופ. לפיכך, לאחר הדגירה על התאים עם חרוזי Concanavalin-A, לשים את צינורות הדגימה על המדף המגנטי, ואת supernatant יש לצפות שוב באמצעות מיקרוסקופ. זאת כדי להעריך באיזו יעילות התאים נלכדו על ידי חרוזי Concanavalin-A. חיץ שטיפה המכיל 7 x 105 תאים/מ"ל ?.......

Discussion

מספר התא הספציפי הנדרש בתגובת CUT&Tag מסוימת מסתמך לחלוטין על העשרת הסימנים/וריאנטים של ההיסטון או חלבונים קושרי כרומטין, שיש לבדוק. בדרך כלל עבור סימני היסטון מועשרים מאוד כגון H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac וכו ', 25,000-50,000 מיובלסטים מספיקים למדי לתגובת CUT&Tag אחת. עם זאת, כמה חלבונים נדירים קושרי כרומטין, עשויי?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16020400 ל- PH); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170804 ל-PH).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bFGFR&D Systems233-FB-025
CollagenCorning354236
Collagenase IIWorthingtonLS004177
Concanavalin-ASigma-AldrichC5275
Concanavalin-A beadsBangs LaboratoriesBP531
DigitoninSigma-Aldrich300410
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
H3K4me1 antibody abcamab8895
Ham's F10 mediaThermo Fisher Scientific11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina VazymeTD903This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubesQualityardQYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripesAnosun MagneticCLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNEBM0541LFor library-making PCR reaction
pA-Tn5VazymeS603-01Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich5056489001
Proteinase KBeyotimeST535-100mg
RPMI-1640 mediaThermo Fisher ScientificC11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)Antibodies-onlineABIN101961
SpermidineSigma-AldrichS2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina VazymeTD202This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads VazymeN411Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating....

Explore More Articles

CUT TagChIPChIPChIP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved