A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.
מאמר פרוטוקול זה נועד לספק לחוקרים החדשים את הפרטים המלאים של השימוש ב- Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) כדי ליצור פרופיל של המיקומים הגנומיים של גורמים קושרי כרומטין, סימני היסטון ווריאנטים של היסטון. פרוטוקולי CUT&Tag מתפקדים היטב עם מיובלסטים של עכברים ותאי גזע שריריים שזה עתה בודדו (MuSCs). הם יכולים בקלות להיות מיושמים על סוגי תאים רבים אחרים כל עוד התאים יכולים להיות משותקים על ידי חרוזי Concanavalin-A. בהשוואה ל- CUT&Tag, מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) הם ניסויים הגוזלים זמן. בדיקות ChIP דורשות טיפול מקדים בכרומטין לפני שניתן יהיה להשתמש בחומר הכרומטי עבור משקעים חיסוניים. ב- cross-linking ChIP (X-ChIP), טיפול מקדים בכרומטין כולל קישור צולב וסוניקציה כדי לשבור את הכרומטין. במקרה של ChIP מקורי (N-ChIP), הכרומטין המקוטע מושג בדרך כלל על ידי עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase). הן סוניקציה והן עיכול MNase מציגים הטיה מסוימת לניסויי ChIP. בדיקות CUT&Tag יכולות להסתיים תוך פחות שלבים ודורשות הרבה פחות תאים בהשוואה ל- ChIPs אך מספקות מידע בלתי משוחד יותר על גורמי שעתוק או סימני היסטון במיקומים גנומיים שונים. CUT&Tag יכול לתפקד עם עד 5,000 תאים בלבד. בשל רגישותו הגבוהה יותר ואות הרקע הנמוך יותר מאשר ChIPs, החוקרים יכולים לצפות לקבל נתוני שיא אמינים רק מכמה מיליוני קריאות לאחר ריצוף.
בדיקת CUT&Tag הומצאה כדי לפצות על כמה פגמים גלויים של ChIPs1. שני החסרונות העיקריים של ChIPs הם 1) ההטיה המוצגת בעת פיצול כרומטין 2) חוסר היכולת לעבוד עם מספרי תאים נמוכים. מבחני X-ChIP מסתמכים על סוניקציה או על עיכול MNase כדי לקבל מקטעי כרומטין, בעוד N-ChIP משתמש בעיקר בעיכול MNase כדי לקבל נוקלאוזומים. סוניקציה מראה הטיה לכיוון מיקומי כרומטין רגועים כגון אזורי מקדם2, וככל הנראה, עיכול MNase עובד ביעילות רבה יותר גם על סיבי כרומטין רגועים. יתר על כן, חלקם דיווחו כי עיכול MNase מראה גם הטיה תלוית רצף DNA3. לכן, בשלב הכנת הקלט של בדיקות ChIP, אי אפשר לקבל קטעי כרומטין מכל מיני מיקומים גנומיים באופ....
השיטות המוצגות בכתב יד זה מאושרות כולן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו. עכברים ששימשו ליצירת התוצאות המייצגות של כתב היד הזה שוכנו ותוחזקו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו.
1. בידוד מיובלסט משרירי הג.......
לפני קשירת תאים לחרוזי Concanavalin-A, בדוק את תרחיף התא מתחת למיקרוסקופ. לפיכך, לאחר הדגירה על התאים עם חרוזי Concanavalin-A, לשים את צינורות הדגימה על המדף המגנטי, ואת supernatant יש לצפות שוב באמצעות מיקרוסקופ. זאת כדי להעריך באיזו יעילות התאים נלכדו על ידי חרוזי Concanavalin-A. חיץ שטיפה המכיל 7 x 105 תאים/מ"ל ?.......
מספר התא הספציפי הנדרש בתגובת CUT&Tag מסוימת מסתמך לחלוטין על העשרת הסימנים/וריאנטים של ההיסטון או חלבונים קושרי כרומטין, שיש לבדוק. בדרך כלל עבור סימני היסטון מועשרים מאוד כגון H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac וכו ', 25,000-50,000 מיובלסטים מספיקים למדי לתגובת CUT&Tag אחת. עם זאת, כמה חלבונים נדירים קושרי כרומטין, עשויי?.......
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16020400 ל- PH); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170804 ל-PH).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen | Corning | 354236 | |
Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved