שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

Summary

חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.

Abstract

מאמר פרוטוקול זה נועד לספק לחוקרים החדשים את הפרטים המלאים של השימוש ב- Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) כדי ליצור פרופיל של המיקומים הגנומיים של גורמים קושרי כרומטין, סימני היסטון ווריאנטים של היסטון. פרוטוקולי CUT&Tag מתפקדים היטב עם מיובלסטים של עכברים ותאי גזע שריריים שזה עתה בודדו (MuSCs). הם יכולים בקלות להיות מיושמים על סוגי תאים רבים אחרים כל עוד התאים יכולים להיות משותקים על ידי חרוזי Concanavalin-A. בהשוואה ל- CUT&Tag, מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) הם ניסויים הגוזלים זמן. בדיקות ChIP דורשות טיפול מקדים בכרומטין לפני שניתן יהיה להשתמש בחומר הכרומטי עבור משקעים חיסוניים. ב- cross-linking ChIP (X-ChIP), טיפול מקדים בכרומטין כולל קישור צולב וסוניקציה כדי לשבור את הכרומטין. במקרה של ChIP מקורי (N-ChIP), הכרומטין המקוטע מושג בדרך כלל על ידי עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase). הן סוניקציה והן עיכול MNase מציגים הטיה מסוימת לניסויי ChIP. בדיקות CUT&Tag יכולות להסתיים תוך פחות שלבים ודורשות הרבה פחות תאים בהשוואה ל- ChIPs אך מספקות מידע בלתי משוחד יותר על גורמי שעתוק או סימני היסטון במיקומים גנומיים שונים. CUT&Tag יכול לתפקד עם עד 5,000 תאים בלבד. בשל רגישותו הגבוהה יותר ואות הרקע הנמוך יותר מאשר ChIPs, החוקרים יכולים לצפות לקבל נתוני שיא אמינים רק מכמה מיליוני קריאות לאחר ריצוף.

Introduction

בדיקת CUT&Tag הומצאה כדי לפצות על כמה פגמים גלויים של ChIPs¹. שני החסרונות העיקריים של ChIPs הם 1) ההטיה המוצגת בעת פיצול כרומטין 2) חוסר היכולת לעבוד עם מספרי תאים נמוכים. מבחני X-ChIP מסתמכים על סוניקציה או על עיכול MNase כדי לקבל מקטעי כרומטין, בעוד N-ChIP משתמש בעיקר בעיכול MNase כדי לקבל נוקלאוזומים. סוניקציה מראה הטיה לכיוון מיקומי כרומטין רגועים כגון אזורי מקדם², וככל הנראה, עיכול MNase עובד ביעילות רבה יותר גם על סיבי כרומטין רגועים. יתר על כן, חלקם דיווחו כי עיכול MNase מראה גם הטיה תלוית רצף DNA³. לכן, בשלב הכנת הקלט של בדיקות ChIP, אי אפשר לקבל קטעי כרומטין מכל מיני מיקומים גנומיים באופ....

Protocol

השיטות המוצגות בכתב יד זה מאושרות כולן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו. עכברים ששימשו ליצירת התוצאות המייצגות של כתב היד הזה שוכנו ותוחזקו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו.

1. בידוד מיובלסט משרירי הג.......

Discussion

מספר התא הספציפי הנדרש בתגובת CUT&Tag מסוימת מסתמך לחלוטין על העשרת הסימנים/וריאנטים של ההיסטון או חלבונים קושרי כרומטין, שיש לבדוק. בדרך כלל עבור סימני היסטון מועשרים מאוד כגון H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac וכו ', 25,000-50,000 מיובלסטים מספיקים למדי לתגובת CUT&Tag אחת. עם זאת, כמה חלבונים נדירים קושרי כרומטין, עשויי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size