Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Исследователи, не знакомые с эпигенетической областью, обнаружат, что CUT&Tag является значительно более простой альтернативой анализам ChIP. Система CUT&Tag оказала огромную пользу эпигенетическим исследованиям редких и первичных клеточных популяций, получив высококачественные данные из очень небольшого числа клеток. Этот протокол описывает проведение анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши.

Abstract

Этот документ по протоколу направлен на то, чтобы предоставить новым исследователям полную информацию об использовании технологии Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) для профилирования геномных мест связывающих хроматин-связывающих факторов, меток гистонов и вариантов гистонов. Протоколы CUT&Tag очень хорошо работают с мышиными миобластами и свежевыделенными мышечными стволовыми клетками (MuSC). Они могут быть легко применены ко многим другим типам клеток, при условии, что клетки могут быть иммобилизованы шариками Конканавалина-А. По сравнению с CUT&Tag, иммунопреципитация хроматина (ChIP) является трудоемким экспериментом. Анализы ChIP требуют предварительной обработки хроматина перед тем, как хроматический материал можно будет использовать для иммунопреципитации. При сшивании ChIP (X-ChIP) предварительная обработка хроматина включает в себя сшивку и ультразвук для фрагментации хроматина. В случае нативного ChIP (N-ChIP) фрагментированные хроматины обычно достигаются путем расщепления микрококковой нуклеазы (MNase). Как ультразвуковая терапия, так и переваривание MNазы вносят некоторую предвзятость в эксперименты с ChIP. Анализы CUT&Tag могут быть завершены за меньшее количество этапов и требуют гораздо меньшего количества клеток по сравнению с ChIP, но обеспечивают более объективную информацию о факторах транскрипции или метках гистонов в различных геномных местах. CUT&Tag может работать всего с 5 000 ячеек. Благодаря более высокой чувствительности и более низкому фоновому сигналу по сравнению с ChIP, исследователи могут рассчитывать на получение надежных пиковых данных всего за несколько миллионов прочтений после секвенирования.

Introduction

Тест CUT&Tag был изобретен для компенсации некоторых явных недостатков ChIPs1. Двумя основными недостатками ChIPs являются: 1) смещение, возникающее при фрагментации хроматина, и 2) неспособность работать с малым числом клеток. Анализы X-ChIP основаны либо на ультразвуковом расщеплении, либо на расщеплении MNазы для получения фрагментов хроматина, в то время как N-ChIP в основном использует расщепление MNазы для получения нуклеосом. Ультразвуковая обработка показывает смещение в сторону ослабленных мест расположения хроматина, таких как промоторные области2, и, по-видимому, переваривание МНазы также более эффективно рабо....

Protocol

Все методы, представленные в этой рукописи, одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию лаборатории в Гуанчжоу. Мыши, использованные для получения репрезентативных результатов этой рукописи, содержались и содержались в соответствии с руководящими ?.......

Representative Results

Прежде чем связывать клетки с шариками Конканавалина-А, проверьте клеточную суспензию под микроскопом. Соответственно, после инкубации клеток с шариками Конканавалина-А пробирки с образцами помещают на магнитный штатив, а надосадочную жидкость следует снова наблюдать с помощью микро.......

Discussion

Конкретное количество клеток, необходимое для определенной реакции CUT&Tag, полностью зависит от обогащения гистоновыми метками/вариантами или хроматин-связывающими белками, которые должны быть исследованы. Обычно для сильно обогащенных гистоновых меток, таких как H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac и т.д., 25.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Программой стратегических приоритетных исследований Китайской академии наук (XDA16020400-PH); Национальный фонд естественных наук Китая (32170804-PH).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bFGFR&D Systems233-FB-025
CollagenCorning354236
Collagenase IIWorthingtonLS004177
Concanavalin-ASigma-AldrichC5275
Concanavalin-A beadsBangs LaboratoriesBP531
DigitoninSigma-Aldrich300410
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
H3K4me1 antibody abcamab8895
Ham's F10 mediaThermo Fisher Scientific11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina VazymeTD903This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubesQualityardQYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripesAnosun MagneticCLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNEBM0541LFor library-making PCR reaction
pA-Tn5VazymeS603-01Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich5056489001
Proteinase KBeyotimeST535-100mg
RPMI-1640 mediaThermo Fisher ScientificC11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)Antibodies-onlineABIN101961
SpermidineSigma-AldrichS2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina VazymeTD202This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads VazymeN411Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CUT TagChIPChIPChIP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved