A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Исследователи, не знакомые с эпигенетической областью, обнаружат, что CUT&Tag является значительно более простой альтернативой анализам ChIP. Система CUT&Tag оказала огромную пользу эпигенетическим исследованиям редких и первичных клеточных популяций, получив высококачественные данные из очень небольшого числа клеток. Этот протокол описывает проведение анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши.
Этот документ по протоколу направлен на то, чтобы предоставить новым исследователям полную информацию об использовании технологии Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) для профилирования геномных мест связывающих хроматин-связывающих факторов, меток гистонов и вариантов гистонов. Протоколы CUT&Tag очень хорошо работают с мышиными миобластами и свежевыделенными мышечными стволовыми клетками (MuSC). Они могут быть легко применены ко многим другим типам клеток, при условии, что клетки могут быть иммобилизованы шариками Конканавалина-А. По сравнению с CUT&Tag, иммунопреципитация хроматина (ChIP) является трудоемким экспериментом. Анализы ChIP требуют предварительной обработки хроматина перед тем, как хроматический материал можно будет использовать для иммунопреципитации. При сшивании ChIP (X-ChIP) предварительная обработка хроматина включает в себя сшивку и ультразвук для фрагментации хроматина. В случае нативного ChIP (N-ChIP) фрагментированные хроматины обычно достигаются путем расщепления микрококковой нуклеазы (MNase). Как ультразвуковая терапия, так и переваривание MNазы вносят некоторую предвзятость в эксперименты с ChIP. Анализы CUT&Tag могут быть завершены за меньшее количество этапов и требуют гораздо меньшего количества клеток по сравнению с ChIP, но обеспечивают более объективную информацию о факторах транскрипции или метках гистонов в различных геномных местах. CUT&Tag может работать всего с 5 000 ячеек. Благодаря более высокой чувствительности и более низкому фоновому сигналу по сравнению с ChIP, исследователи могут рассчитывать на получение надежных пиковых данных всего за несколько миллионов прочтений после секвенирования.
Тест CUT&Tag был изобретен для компенсации некоторых явных недостатков ChIPs1. Двумя основными недостатками ChIPs являются: 1) смещение, возникающее при фрагментации хроматина, и 2) неспособность работать с малым числом клеток. Анализы X-ChIP основаны либо на ультразвуковом расщеплении, либо на расщеплении MNазы для получения фрагментов хроматина, в то время как N-ChIP в основном использует расщепление MNазы для получения нуклеосом. Ультразвуковая обработка показывает смещение в сторону ослабленных мест расположения хроматина, таких как промоторные области2, и, по-видимому, переваривание МНазы также более эффективно рабо....
Все методы, представленные в этой рукописи, одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию лаборатории в Гуанчжоу. Мыши, использованные для получения репрезентативных результатов этой рукописи, содержались и содержались в соответствии с руководящими ?.......
Прежде чем связывать клетки с шариками Конканавалина-А, проверьте клеточную суспензию под микроскопом. Соответственно, после инкубации клеток с шариками Конканавалина-А пробирки с образцами помещают на магнитный штатив, а надосадочную жидкость следует снова наблюдать с помощью микро.......
Конкретное количество клеток, необходимое для определенной реакции CUT&Tag, полностью зависит от обогащения гистоновыми метками/вариантами или хроматин-связывающими белками, которые должны быть исследованы. Обычно для сильно обогащенных гистоновых меток, таких как H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac и т.д., 25.......
Эта работа была поддержана Программой стратегических приоритетных исследований Китайской академии наук (XDA16020400-PH); Национальный фонд естественных наук Китая (32170804-PH).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen | Corning | 354236 | |
Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved