Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает реконфигурируемую платформу клеточных культур на основе мембраны, которая объединяет формат открытой лунки с возможностями потока жидкости. Эта платформа совместима со стандартными протоколами и позволяет осуществлять обратимые переходы между режимами культивирования в открытых лунках и микрофлюидными культурами, удовлетворяя потребности как инженерных, так и бионаучных лабораторий.

Abstract

Микрофизиологические системы представляют собой миниатюрные платформы для клеточных культур, используемые для имитации структуры и функций тканей человека в лабораторных условиях. Тем не менее, эти платформы не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях, где мембранные подходы с открытыми лунками служат золотым стандартом для имитации тканевых барьеров, несмотря на отсутствие возможностей для потока жидкости. Эта проблема может быть связана, прежде всего, с несовместимостью существующих микрофизиологических систем со стандартными протоколами и инструментами, разработанными для систем с открытыми лунками.

В этой статье мы представляем протокол для создания реконфигурируемой мембранной платформы со структурой открытого ствола, возможностью увеличения потока и совместимостью с обычными протоколами. В этой системе используется подход магнитной сборки, который обеспечивает обратимое переключение между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом. При таком подходе пользователи могут начать эксперимент в формате открытой скважины с использованием стандартных протоколов и добавлять или удалять возможности потока по мере необходимости. Для демонстрации практического использования этой системы и ее совместимости со стандартными методиками был создан монослой эндотелиальных клеток в формате открытого лунки. Система была перенастроена для введения потока жидкости, а затем переведена в формат открытой лунки для проведения иммуноокрашивания и экстракции РНК. Благодаря совместимости с традиционными протоколами работы с открытыми скважинами и возможности увеличения потока, ожидается, что эта реконфигурируемая конструкция будет принята как инженерными, так и биологическими лабораториями.

Introduction

Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань 1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии 3,4.

Наиболее широко используем....

Protocol

Данная конструкция может использоваться в различных режимах исходя из экспериментальных требований и предпочтений конечного пользователя. Перед каждым экспериментом сверяйтесь с блок-схемой принятия решений, представленной на рисунке 2 , чтобы определить необходимы?.......

Representative Results

Модуль керна открытого колодца первоначально размещается в специальной полости, образованной нижним корпусом и покровным стеклом, как показано на рисунке 6A. Затем модуль потока, включающий в себя микроканал и порты доступа, вставляется в лунку основного модуля. Модуль .......

Discussion

Целью данного протокола является разработка практического метода включения возможностей потока в открытую платформу с ультратонкой наномембраной. В данной конструкции используется магнитная фиксация, позволяющая переключаться между открытым и флюидным режимами во время экспериме?.......

Acknowledgements

Это исследование было частично профинансировано Национальным институтом здравоохранения в рамках грантов R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 и гранта NSF CBET 2150798. Авторы благодарят RIT Machine Shop за изготовление алюминиевых форм. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubesLanger InstrumentsWX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra MiltexVWR95039-090
1x PBS 7.4 pHThermoFisher Scientific10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIPJensen GlobalJG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIPJensen GlobalJG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)DigiKey3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)DigiKey3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidinThermoFisher ScientificA12379 
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 gVWRAAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8560K17112" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8589K3112" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8560K19112" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mgCorning47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mmVWR10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KITEllsworth Adhesives4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fixture A1&A2SiMPore Inc.NA
Fixture B1&B2SiMPore Inc.NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorThermo Fisher Scientific4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)ThermoFisher ScientificC0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)Thermo Fisher ScientificR37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)K&J MagneticsD313/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa AesarFisher Scientificaa47392-9M
Peristaltic PumpLanger InstrumentsBQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solutionFisher ScientificNC9901158
PVDF syringe filtersPerkinElmer2542913
Silicon waferUniversity wafer,USA1196
SU-8 3050Fisher ScientificNC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)ThermoFisher Scientific4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, SterileVWR100500-422
TRI-reagentThermoFisher ScientificAM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane ChipSiMPore Inc.NPSN100-1LThe design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1SiMPore Inc.NA
uSiM component 2SiMPore Inc.NA

References

  1. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
  2. Vera, D., et al.

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved