Преобразование статических барьерных моделей тканей в динамические микрофизиологические системы

Summary

Этот протокол описывает реконфигурируемую платформу клеточных культур на основе мембраны, которая объединяет формат открытой лунки с возможностями потока жидкости. Эта платформа совместима со стандартными протоколами и позволяет осуществлять обратимые переходы между режимами культивирования в открытых лунках и микрофлюидными культурами, удовлетворяя потребности как инженерных, так и бионаучных лабораторий.

Abstract

Микрофизиологические системы представляют собой миниатюрные платформы для клеточных культур, используемые для имитации структуры и функций тканей человека в лабораторных условиях. Тем не менее, эти платформы не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях, где мембранные подходы с открытыми лунками служат золотым стандартом для имитации тканевых барьеров, несмотря на отсутствие возможностей для потока жидкости. Эта проблема может быть связана, прежде всего, с несовместимостью существующих микрофизиологических систем со стандартными протоколами и инструментами, разработанными для систем с открытыми лунками.

В этой статье мы представляем протокол для создания реконфигурируемой мембранной платформы со структурой открытого ствола, возможностью увеличения потока и совместимостью с обычными протоколами. В этой системе используется подход магнитной сборки, который обеспечивает обратимое переключение между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом. При таком подходе пользователи могут начать эксперимент в формате открытой скважины с использованием стандартных протоколов и добавлять или удалять возможности потока по мере необходимости. Для демонстрации практического использования этой системы и ее совместимости со стандартными методиками был создан монослой эндотелиальных клеток в формате открытого лунки. Система была перенастроена для введения потока жидкости, а затем переведена в формат открытой лунки для проведения иммуноокрашивания и экстракции РНК. Благодаря совместимости с традиционными протоколами работы с открытыми скважинами и возможности увеличения потока, ожидается, что эта реконфигурируемая конструкция будет принята как инженерными, так и биологическими лабораториями.

Introduction

Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань ^1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии ^3,4.

Наиболее широко используем....

Protocol

Данная конструкция может использоваться в различных режимах исходя из экспериментальных требований и предпочтений конечного пользователя. Перед каждым экспериментом сверяйтесь с блок-схемой принятия решений, представленной на рисунке 2 , чтобы определить необходимы?.......

Discussion

Целью данного протокола является разработка практического метода включения возможностей потока в открытую платформу с ультратонкой наномембраной. В данной конструкции используется магнитная фиксация, позволяющая переключаться между открытым и флюидным режимами во время экспериме?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA