Misurazione della lunghezza della coda di Poly A dal cervello e dalla linea cellulare della larva di Drosophila

Summary

Il protocollo descrive un metodo efficiente e affidabile per quantificare la lunghezza del poli(A) del gene di interesse dal sistema nervoso della Drosophila , che può essere facilmente adattato a tessuti o tipi cellulari di altre specie.

Abstract

La poliadenilazione è una modificazione post-trascrizionale cruciale che aggiunge code di poli(A) all'estremità 3' delle molecole di mRNA. La lunghezza della coda poli(A) è strettamente regolata dai processi cellulari. La disregolazione della poliadenilazione dell'mRNA è stata associata a un'espressione genica anomala e a varie malattie, tra cui cancro, disturbi neurologici e anomalie dello sviluppo. Pertanto, comprendere le dinamiche della poliadenilazione è fondamentale per svelare le complessità dell'elaborazione dell'mRNA e della regolazione genica post-trascrizionale.

Questo articolo presenta un metodo per misurare la lunghezza della coda di poli(A) in campioni di RNA isolati da cervelli larvali di Drosophila e cellule S2 di Drosophila Schneider. Abbiamo utilizzato l'approccio di coda della guanosina/inosina (G/I), che prevede l'aggiunta enzimatica di residui di G/I all'estremità 3' dell'mRNA utilizzando la poli(A) polimerasi del lievito. Questa modifica protegge l'estremità 3' dell'RNA dalla degradazione enzimatica. Le code protette in poli(A) a tutta lunghezza vengono quindi trascritte inversamente utilizzando un primer antisenso universale. Successivamente, l'amplificazione PCR viene eseguita utilizzando un oligo gene-specifico che ha come bersaglio il gene di interesse, insieme a un oligo di sequenza universale utilizzato per la trascrizione inversa.

Questo genera prodotti di PCR che comprendono le code di poli(A) del gene di interesse. Poiché la poliadenilazione non è una modifica uniforme e si traduce in code di lunghezza variabile, i prodotti PCR mostrano una gamma di dimensioni, portando a un modello di striscio sul gel di agarosio. Infine, i prodotti PCR vengono sottoposti a elettroforesi su gel capillare ad alta risoluzione, seguita da quantificazione utilizzando le dimensioni dei prodotti poly(A) PCR e del prodotto PCR gene-specifico. Questa tecnica offre uno strumento semplice e affidabile per l'analisi delle lunghezze della coda di poli(A), consentendoci di ottenere informazioni più approfondite sugli intricati meccanismi che regolano la regolazione dell'mRNA.

Introduction

La maggior parte degli mRNA eucariotici sono post-trascrizionalmente poliadenilati al loro terminale 3′ nel nucleo mediante l'aggiunta di adenosine non modellate da poli(A) polimerasi canoniche. Una coda di poli(A) intatta è fondamentale per tutto il ciclo di vita dell'mRNA, in quanto è essenziale per l'esportazione nucleare dell'mRNA¹, facilita l'interazione con le proteine che legano il poli(A) per migliorare l'efficienza traduzionale² e conferisce resistenza alla degradazione³. In alcuni casi, la coda di poli(A) può anche subire un'estensione nel citoplasma, facilitata dalle poli(A) polimerasi ....

Protocol

1. Allevamento e selezione delle larve di Drosophila

1. Mantenere/coltivare il ceppo di mosca (w¹¹¹⁸, wildtype) su terreno di coltura standard a 25 °C in un'incubatrice umidificata.
2. Selezionare 10 larve vaganti di 3^° stadio 72 h dopo la deposizione delle uova.
3. Mettere le larve in una capsula di Petri vuota da 35 mm e lavarle delicatamente trasferendole nella nuova capsula contenente l'acqua del rubinett.......

Discussion

In questo protocollo, descriviamo la tecnica per sezionare il cervello larvale di Drosophila dal 3^° stadio di stadio errante e la preparazione del campione dalle cellule di Drosophila S2. A causa della natura labile degli mRNA, la raccolta dei campioni richiede particolare cautela. Per la dissezione cerebrale larvale, il cervello non deve essere danneggiato durante l'isolamento e non deve essere tenuto in soluzione per una durata prolungata. È essenziale mantenere il tempo di dissezione a 8.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49