Измерение длины хвоста Poly A из головного мозга и клеточной линии личинки дрозофилы

Summary

Протокол описывает эффективный и надежный метод количественной оценки длины поли(А) интересующего гена из нервной системы дрозофилы , который может быть легко адаптирован к тканям или типам клеток других видов.

Abstract

Полиаденилирование является важнейшей посттранскрипционной модификацией, которая добавляет поли(А)-хвосты к 3'-концу молекул мРНК. Длина поли(А)-хвоста жестко регулируется клеточными процессами. Дисрегуляция полиаденилирования мРНК связана с аномальной экспрессией генов и различными заболеваниями, включая рак, неврологические расстройства и аномалии развития. Таким образом, понимание динамики полиаденилирования имеет жизненно важное значение для разгадки сложностей процессинга мРНК и посттранскрипционной регуляции генов.

В данной работе представлен метод измерения длины поли(А)-хвоста в образцах РНК, выделенных из головного мозга личинок дрозофилы и клеток S2 Drosophila Schneider. Мы использовали подход гуанозин/инозин (G/I), который включает ферментативное добавление остатков G/I на 3'-конце мРНК с использованием дрожжевой поли(А)-полимеразы. Эта модификация защищает 3'-конец РНК от ферментативной деградации. Защищенные полноразмерные поли(А)-хвосты затем ретранскрибируются с помощью универсального антисмыслового праймера. Впоследствии ПЦР-амплификация выполняется с использованием ген-специфического олиго, нацеленного на интересующий ген, а также олиго универсальной последовательности, используемого для обратной транскрипции.

В результате образуются ПЦР-продукты, охватывающие поли(А)-хвосты интересующего гена. Поскольку полиаденилирование не является однородной модификацией и приводит к образованию хвостов различной длины, продукты ПЦР имеют диапазон размеров, что приводит к образованию мазка на агарозном геле. Наконец, продукты ПЦР подвергают электрофорезу в капиллярном геле высокого разрешения с последующим количественным определением с использованием размеров продуктов поли(А) ПЦР и ген-специфического продукта ПЦР. Этот метод предлагает простой и надежный инструмент для анализа длины поли(А)-хвоста, что позволяет нам получить более глубокое представление о сложных механизмах, управляющих регуляцией мРНК.

Introduction

Большинство эукариотических мРНК посттранскрипционно полиаденилированы на своем 3'-конце в ядре путем добавления нематричных аденозинов каноническими поли(А)-полимеразами. Неповрежденный поли(А)-хвост имеет решающее значение на протяжении всего жизненного цикла мРНК, поскольку он необходим для ядерного экспорта мРНК¹, облегчает взаимодействие с поли(А)-связывающими белками для повышения трансляционной эффективности² и придает устойчивость к деградации³. В некоторых случаях поли(А)-хвост также может подвергаться удлинению в цитоплазме, чему способствуют неканонические поли(А)полимеразы

Protocol

1. Выращивание и отбор личинок дрозофилы

1. Поддерживать/культивировать штамм мух (w¹¹¹⁸, дикий тип) на стандартной кормовой среде для мух при 25 °C во увлажненном инкубаторе.
2. Отобрать 10 блуждающих личинок^3-го возраста через 72 ч после ?.......

Discussion

В этом протоколе мы описываем технику вскрытия мозга личинки дрозофилы из блуждающей стадии^3-го возраста, а также подготовку образца из клеток Drosophila S2. Из-за лабильного характера мРНК сбор образцов требует особой осторожности. При вскрытии головного мозга личинок мозг н.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Research Product Internation (RPI)	M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Research Product Internation (RPI)	D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x)	New England biolabs	B7024S
Drosophila S2 cell line	Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium	Thermo Fisher Scientific	21720024
Ehidium bromide	Genesee scientific	20-276
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
Forceps Dumont 5	Fine Science tools	11254-20
Nuclease free water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
PBS 10x	Research Product Internation (RPI)	P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher Scientific	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
RNA miniprep kit	Zymoresearch	R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge	Fine Science tools	15000-08
TopVision Agarose Tablets	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)	Thermo Fisher Scientific	B49