Este protocolo descreve um procedimento para impressão tridimensional (3D) de colônias bacterianas para estudar sua motilidade e crescimento em matrizes complexas de hidrogel poroso 3D que são mais semelhantes aos seus habitats naturais do que culturas líquidas convencionais ou placas de Petri.
As bactérias são ubíquas em ambientes porosos tridimensionais complexos (3D), como tecidos biológicos e géis, solos subsuperficiais e sedimentos. No entanto, a maioria dos trabalhos anteriores tem se concentrado em estudos de células em líquidos a granel ou em superfícies planas, que não recapitulam totalmente a complexidade de muitos habitats bacterianos naturais. Aqui, essa lacuna no conhecimento é abordada descrevendo o desenvolvimento de um método para imprimir colônias densas de bactérias em 3D em matrizes de hidrogel granulares emperradas. Essas matrizes possuem tamanhos de poros ajustáveis e propriedades mecânicas; eles confinam fisicamente as células, suportando-as em 3D. Eles são opticamente transparentes, permitindo a visualização direta da disseminação bacteriana através de seus arredores usando imagens de imagem. Como prova desse princípio, aqui, a capacidade deste protocolo é demonstrada pela impressão 3D e imageamento de Vibro cholerae não móveis e móveis, bem como Escherichia coli não móvel, em matrizes granulares de hidrogel emperradas com tamanhos variados de poros intersticiais.
As bactérias frequentemente habitam diversos e complexos ambientes porosos 3D, desde géis mucosos no intestino e pulmões até solo no solo 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. Nesses cenários, o movimento bacteriano através da motilidade ou crescimento pode ser impedido por obstáculos circundantes, como redes poliméricas ou embalagens de grãos minerais sólidos, influenciando a capacidade das células de se espalhar por seus ambientes26, acessar fontes de nutrientes, colonizar novos terrenos e formar comunidades protetoras de biofilme27. No entanto, estudos de laboratório tradicionais normalmente empregam geometrias altamente simplificadas, com foco em células em culturas líquidas ou em superfícies planas. Embora essas abordagens produzam insights importantes sobre a microbiologia, elas não recapitulam totalmente a complexidade dos habitats naturais, levando a diferenças dramáticas nas taxas de crescimento e no comportamento da motilidade em comparação com medições realizadas em ambientes do mundo real. Portanto, um método para definir colônias bacterianas e estudar sua motilidade e crescimento em ambientes porosos 3D mais semelhantes a muitos de seus habitats naturais é extremamente necessário.
Inocular células em gel de ágar e, em seguida, visualizar sua disseminação macroscópica por olho ou usando uma câmera fornece uma maneira simples de conseguir isso, como proposto pela primeira vez por Tittsler e Sandholzer em 193628. No entanto, essa abordagem sofre de uma série de desafios técnicos importantes: (1) Embora os tamanhos dos poros possam, em princípio, ser variados variando a concentração de agarose, a estrutura dos poros de tais géis é mal definida; (2) O espalhamento de luz faz com que esses géis sejam turvos, dificultando a visualização de células em escala individual com alta resolução e fidelidade, particularmente em grandes amostras; (3) Quando a concentração de ágar é muito grande, a migração celular é restrita à superfície plana superior do gel; (4) A complexa reologia desses géis torna desafiadora a introdução de inóculos com geometrias bem definidas.
Para resolver essas limitações, em trabalhos anteriores, o laboratório de Datta desenvolveu uma abordagem alternativa usando matrizes granulares de hidrogel - compostas por partículas de hidrogel biocompatíveis inchadas em cultura bacteriana líquida - como "placas de Petri porosas" para confinar células em 3D. Essas matrizes são sólidas macias, auto-reparáveis, de tensão de escoamento; assim, ao contrário dos géis reticulados usados em outros processos de bioimpressão, um microbocal de injeção pode mover-se livremente dentro da matriz ao longo de qualquer caminho 3D prescrito, reorganizando localmente as partículas de hidrogel29. Essas partículas então se redensificam rapidamente e se auto-curam ao redor das bactérias injetadas, apoiando as células no lugar sem qualquer processamento prejudicial adicional. Este processo é, portanto, uma forma de impressão 3D que permite que as células bacterianas sejam dispostas - em uma estrutura 3D desejada, com uma composição de comunidade definida - dentro de uma matriz porosa com propriedades físico-químicas ajustáveis. Além disso, as matrizes de hidrogel são completamente transparentes, permitindo que as células sejam visualizadas diretamente por imagem.
A utilidade dessa abordagem foi demonstrada anteriormente de duas maneiras. Em um conjunto de estudos, células diluídas foram dispersas por toda a matriz hidrogel, o que possibilitou estudos da motilidade de bactérias individuais30,31. Em outro conjunto de estudos, comunidades multicelulares foram impressas em 3D em géis em escala centimétrica usando um bico injetor montado em um palco de microscópio programável, o que possibilitou estudos da disseminação de coletivos bacterianos em seu entorno32,33. Em ambos os casos, esses estudos revelaram diferenças até então desconhecidas nas características de disseminação de bactérias que habitam ambientes porosos em comparação com aquelas em cultura líquida/em superfícies planas. No entanto, por terem sido montados em um estágio de microscópio, esses estudos anteriores foram limitados a pequenos volumes de amostra (~1 mL) e, portanto, a escalas de tempo experimentais curtas. Eles também foram limitados em sua capacidade de definir geometrias de inóculos com alta resolução espacial.
Aqui, a próxima geração desta plataforma experimental que aborda ambas as limitações é descrita. Especificamente, são fornecidos protocolos pelos quais se pode usar uma impressora 3D modificada com uma extrusora de seringa acoplada à impressão 3D e imagem de colônias bacterianas em grandes escalas. Além disso, dados representativos indicam como esta abordagem pode ser útil para estudar a motilidade e o crescimento de bactérias, usando o biofilme Vibrio cholerae e a Escherichia coli planctônica como exemplos. Essa abordagem permite que as colônias bacterianas sejam sustentadas por longos tempos e visualizadas usando várias técnicas de imagem. Assim, a capacidade dessa abordagem de estudar comunidades bacterianas em habitats porosos 3D tem um enorme potencial de pesquisa e aplicação, impactando o tratamento e o estudo de micróbios no intestino, na pele, no pulmão e no solo. Além disso, essa abordagem pode ser usada no futuro para impressão 3D de materiais vivos projetados à base de bactérias em formas independentes mais complexas.
Esta abordagem consiste em converter uma impressora comercial de modelagem de deposição fundida 3D em uma bioimpressora 3D usando um protocolo previamente estabelecido por Tashman et al.34. Em resumo, Tashman e colaboradores substituíram uma cabeça de extrusora comercial por uma extrusora de bomba de seringa personalizada. Esta extrusora permite a impressão de suspensões líquidas altamente concentradas de células bacterianas em 3D, com seu volume extrudado e posição 3D controlados pela linguagem de programação G-code. O volume extrudado é especificado no software pela etapa da extrusora (E-step) e é adicionalmente calibrado conforme descrito abaixo. Essas suspensões bacterianas são, portanto, impressas diretamente em uma matriz granular de hidrogel, que atua como um suporte 3D para as células. Abaixo, o protocolo também descreve como preparar matrizes com diferentes concentrações de polímeros, caracterizar as mudanças resultantes no tamanho dos poros e propriedades reológicas, e caracterizar a motilidade e o crescimento bacterianos subsequentes usando imagens diretas.
1. Conversão de uma impressora 3D comercial em uma bioimpressora 3D
2. Preparação da suspensão bacteriana
3. Carregar a suspensão bacteriana na seringa
NOTA: São fornecidos dois métodos para carregar as bactérias na seringa (passo 3.1 e passo 3.2). O passo 3.1 trabalha para carregar pequenos volumes de suspensões bacterianas, <200 μL, e o passo 3.2 trabalha para carregar volumes maiores de suspensões bacterianas, >200 μL. A etapa 3.1 foi utilizada para os resultados representativos aqui apresentados.
4. Calibração da etapa da extrusora para o volume depositado
5. Preparação da matriz de hidrogel granular
6. Caracterização das propriedades reológicas da matriz de hidrogel granular
7. Caracterização do tamanho dos poros intersticiais da matriz de hidrogel granular
8. 3D processo de impressão
9. Crescimento e obtenção de imagens da V. cholerae
O uso de uma bioimpressora 3D com a matriz granular de hidrogel expande as capacidades das bioimpressoras para imprimir colônias bacterianas em formas que, quando impressas em um substrato plano, cairiam devido à baixa viscosidade da suspensão bacteriana. A resolução da abordagem aqui apresentada depende da velocidade de extrusão, tamanho da agulha, velocidade da cabeça de impressão, ar na agulha e viscosidade da suspensão bacteriana. Devido ao baixo volume de suspensão bacteriana, bolhas de ar podem ser introduzidas inadvertidamente durante o carregamento da suspensão bacteriana na seringa e agulha. Isso pode levar ao depósito de uma bolha de ar na estrutura impressa final (Figura 4). Outra maneira de introduzir bolhas de ar na impressão é se não pressionar o êmbolo para formar uma pequena gota de suspensão bacteriana na ponta da agulha antes de imprimir e existir uma folga de ar na ponta da agulha. Não deprimir o êmbolo da seringa antes da impressão também pode levar a diferentes volumes de células sendo impressos no mesmo lote. No entanto, com o passar do tempo, a bolha de ar se dissolve no meio circundante, como mostrado na Figura 4.
Para calibrar a etapa de extrusão, o volume depositado depende de como o atuador linear da cabeça de impressão traduz o êmbolo da seringa, o diâmetro interno da seringa impactará diretamente o volume. Além disso, as propriedades reológicas da suspensão bacteriana afetarão a facilidade com que eles cortam a contração da agulha para imprimir suavemente. Assim, esse procedimento de calibração deve ser refeito para cada instalação de seringa/agulha/suspensão bacteriana. Em princípio, a calibração da seringa poderia ser automatizada. No entanto, na prática, escrever um código que se aplique amplamente a muitos casos de uso seria um desafio. Por exemplo, um usuário com o objetivo de calibrar a extrusão de aproximadamente 300 μL a partir de uma seringa de 1 mL precisaria recarregar a seringa com muito mais frequência do que um usuário calibrando em torno de um volume alvo de 30 μL. Como a constante de calibração E-step to volume é desconhecida quando o processo de calibração começa, o usuário pode não ser capaz de prever exatamente com que frequência o recarregamento é realmente necessário. Além disso, para automatizar o processo de calibração, as posições exatas de cada tubo de 1,5 mL pré-pesado precisariam ser especificadas. Para garantir que toda a biotinta seja depositada da agulha no tubo para uma calibração precisa, deve ser feito um contacto preciso entre a agulha e o fundo/parede do tubo. Sem um bom contato, pequenas gotículas podem permanecer molhadas e presas à agulha. Assim, qualquer variação posicional entre os tubos pode contribuir sobremaneira para erros no processo de calibração. Por essas razões, os autores recomendam que cada usuário construa um programa de calibração que atenda às suas necessidades únicas.
Uma característica chave da abordagem apresentada aqui é a capacidade de visualizar bactérias se espalhando por seus ambientes diretamente via motilidade e crescimento usando imagens de imagem. Em uma versão anterior do protocolo de aquisição de imagens, placas de 6 poços foram preenchidas com 19 mL de uma matriz granular de hidrogel. No entanto, mesmo com uma impressão 3D bem-sucedida de uma linha horizontal de células que pôde ser observada em um microscópio invertido, uma colônia densa também cresceria na superfície superior do meio, limitando a visualização com microscopia de campo claro (Figura 5). A colônia na superfície superior provavelmente resultou de contaminação quando a agulha da seringa foi colocada ou removida do meio durante a impressão. Para contornar esse problema, linhas verticais de células são impressas em frascos de cintilação (Figura 6A). No entanto, a curvatura dos frascos cilíndricos causou distorção durante a aquisição de imagens. Isso levou à seleção de cubetas de paredes planas e frascos de cultura de tecidos como recipientes de amostra para impressão, permitindo imagens não distorcidas (Figura 6B-D). Uma limitação dos frascos de cultura de tecidos é o pequeno pescoço inclinado que limita as geometrias que podem ser impressas.
Em conjunto, este protocolo permite a observação da motilidade e crescimento bacteriano em ambientes porosos complexos em longas escalas de tempo. Alguns exemplos são mostrados na Figura 6B-G para V. cholerae formadores de biofilme usando microscopia de campo claro, bem como células planctônicas de E. coli usando microscopia confocal de fluorescência de varredura a laser, demonstrando a versatilidade desta abordagem. De fato, um problema potencial das matrizes de hidrogel é sua possível autofluorescência quando imageadas usando microscopia de fluorescência; entretanto, as imagens mostradas na Figura 6F,G demonstram que esta autofluorescência é mínima na plataforma experimental aqui apresentada. Outra limitação de tais abordagens de microscopia óptica é sua resolução espacial, que é definida pelo limite de difração em ~100 s nanômetros; no entanto, essa escala de comprimento é muito menor do que o tamanho de uma célula bacteriana individual e, portanto, as técnicas ópticas fornecem a capacidade de obter imagens de células bacterianas desde a escala de células individuais (Figura 6G) até a escala de colônias multicelulares maiores 30,31,32,33. Exemplos adicionais são descritos abaixo.
Como observado acima, a abordagem aqui apresentada pode ser usada para imprimir em 3D e obter imagens de colônias bacterianas em pequenos volumes de matriz (1 mL) e grandes (20 mL). Assim, as diferenças nos resultados obtidos com diferentes volumes são descritas a seguir, utilizando colônias impressas em 3D de V. cholerae móvel e não móvel como exemplos representativos. A resolução espacial (largura da linha) da impressão é definida pelo diâmetro interno do bocal. Nos exemplos descritos abaixo, uma agulha com diâmetro interno de 0,6 mm resulta em uma colônia cilíndrica inicial de 0,6 mm. Trabalhos anteriores demonstraram que a resolução de impressão pode ser reduzida ainda mais usando um capilar de vidro puxado com um diâmetro interno de ~100-200 μm33.
Para os pequenos volumes, são utilizadas duas matrizes granulares diferentes de hidrogel com duas diferentes distribuições de tamanho de poros: uma com tamanho médio de poro maior que o diâmetro médio de uma célula de V. cholerae, 0,2-0,4 μm36, e outra com tamanho médio de poro menor que esse diâmetro. As amostras ao longo de doze dias são imageadas e medidas através da análise de imagens da expansão areal das colônias ao longo do tempo (Figura 7 e Figura 8). Para as células não móveis, que só podem se espalhar pelo seu entorno através do crescimento celular, a taxa de expansão areal foi semelhante entre as diferentes matrizes investigadas (Figura 7), indicando que as diferenças no tamanho dos poros da matriz não influenciam a disseminação celular através do crescimento - como esperado. Em contraste, para as células móveis que se espalham por seu entorno através da motilidade ativa, a taxa de expansão areal de V. cholerae foi maior para a matriz de hidrogel com os poros maiores - para os quais o confinamento pelos grãos de hidrogel impede menos a motilidade celular. Essas diferenças na disseminação bacteriana também foram aparentes nas morfologias das colônias (Figura 8). A colônia de V. cholerae em matrizes hidrogéis com poros maiores espalhou-se através de plumas lisas e difusas (Figura 8A), refletindo a disseminação através da motilidade ativa, como observado anteriormente32. De fato, consistente com essa interpretação, essas plumas difusas não são observadas no caso de células não móveis (Figura 8C). Além disso, os poros são suficientemente grandes para que as células não empurrem as contas enquanto nadam pelos poros. Além disso, a tensão viscosa aplicada pela natação é inferior a 1 Pa, o que é insuficiente para deformar sensivelmente a matriz de hidrogel circundante. Em contraste, a colônia em matrizes de hidrogel com poros menores se espalha apenas através de plumas ásperas semelhantes a fractais para células móveis e não móveis (Figura 8B,D), refletindo a disseminação apenas através do crescimento celular, enquanto as células crescem transitoriamente deformam e produzem a matriz circundante. De fato, dado que a tensão de escoamento das matrizes de hidrogel é muito menor do que a pressão de turgescência das células, neste limite de tamanho de poros pequenos, a matriz apenas fornece fraca resistência ao crescimento celular e não parece afetar fortemente a estrutura impressa em 3D, também como verificado em nosso trabalho anterior37.
Resultados semelhantes são observados para experimentos realizados em amostras de grande volume; no entanto, dada a maior abundância de nutrientes nessas amostras, os experimentos poderiam sustentar o crescimento celular em escalas de tempo mais longas. Como exemplo, são mostrados resultados usando matrizes de hidrogel granulares onde o tamanho médio dos poros era menor do que o tamanho da célula - e, portanto, a disseminação celular foi principalmente devido ao crescimento. As amostras são fotografadas por ~30 dias nas matrizes granulares de hidrogel e observada expansão areal semelhante para células não móveis e móveis durante as primeiras 150 h; no entanto, em tempos ainda mais longos, observa-se forte variabilidade entre as amostras, com algumas amostras exibindo taxas de espalhamento mais rápidas (Figura 9 e Figura 10). Curiosamente, ao reamostrar a matriz de hidrogel após o experimento - um benefício do grande volume da matriz de hidrogel - uma diminuição na tensão de escoamento, módulos de armazenamento e módulos de perda são medidos (Figura 11), indicando que as matrizes tornaram-se mais macias. Essa alteração pode ser devida ao fato de V . cholerae produzir uma molécula que está alterando as propriedades da matriz hidrogel e promovendo a disseminação celular em longos tempos, o que será interessante testar em pesquisas futuras. Exemplos das morfologias ásperas de colônias semelhantes a fractais que resultam nesses experimentos são mostrados na Figura 10.
Figura 1: Imagens da bioimpressora 3D personalizada. (A) Bioimpressora com cabeça de extrusora de bomba de seringa modificada com seringa e agulha descartáveis Luer lock. A bioimpressora tem ~46 cm de largura. (B) Imagem da impressão 3D de células em frascos preenchidos com matriz de hidrogel emperrada. A largura da imagem é de 87 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização das propriedades reológicas das matrizes granulares de hidrogel. (A) Tensão de cisalhamento em função da taxa de cisalhamento aplicada. (B) Módulos de armazenamento e perda, G' e G'', respectivamente, em função da frequência de oscilação. A legenda indica a fração mássica de hidrogel utilizada para preparar cada matriz de hidrogel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medidas do tamanho dos poros de duas matrizes granulares representativas de hidrogel. Através do rastreamento de traçadores, a distribuição das dimensões de poros características é determinada para cada matriz de hidrogel. Os dados são representados por 1-CDF, onde CDF é a função de distribuição cumulativa. A legenda indica a fração mássica de hidrogel utilizada para preparar cada matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de bolhas formadas durante a impressão 3D de bactérias. (A) Esquema da configuração da imagem. (B) Instantâneos do crescimento de V. cholerae com uma bolha na parte inferior da impressão (caixa vermelha) em matriz de hidrogel a 1,2% inchada em LB. Após 59 h de crescimento a 37 °C, a bolha de ar é totalmente dissolvida e a colônia colapsa de volta devido à elasticidade da matriz de hidrogel. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens da linha horizontal de V. cholerae móvel impressas em uma placa de seis poços preenchida com matriz de hidrogel a 1,2% inchada em LB e o biofilme que se formou na superfície superior após 48 h de incubação a 37 °C. (A) Esquema da configuração da imagem. (B) A formação de biofilme na superfície superior devido à contaminação durante a impressão 3D diminui a opacidade e não permite imagens nítidas da linha horizontal. A superfície superior forma rugas, presumivelmente devido ao crescimento diferencial. Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplos de diferentes recipientes de amostra que podem ser usados neste método. (A) V. cólera impressa num frasco para injetáveis de vidro preenchido com matriz de hidrogel granular a 1,2% após 470 horas. A curvatura do frasco dificulta a obtenção de imagens do crescimento. Barras de escala = 5 mm. (B) V. cholerae impresso em micro-cubeta preenchida com matriz granulada de hidrogel a 1,2%. Os lados planos permitem imagens claras, no entanto, os pequenos volumes limitam a duração dos experimentos antes que as células fiquem sem substratos de crescimento. (C) Configuração de imagem com lente zoom para obtenção de imagens de V. cholerae impressa em frasco de cultura de tecidos preenchido com matriz granular de hidrogel a 1,2%. Semelhante ao caso da micro-cubeta, as laterais planas permitem imagens claras. Os frascos de cultura de tecidos podem ser preenchidos com maiores volumes de matriz granular de hidrogel, prolongando o tempo experimental. (D) Imagem da lente zoom de V. cholerae impressa dentro de uma matriz de hidrogel granular a 1,2% após 100 h de incubação a 37 °C. Barra de escala = 1 mm. (E) Configuração de imagem com microscópio confocal para obtenção de imagens de células fluorescentes. (F) Projeção 3D de micrografias confocais de E. coli fluorescente dentro da matriz de hidrogel granular a 1,2% após 10 dias de incubação a 37 °C. Barra de escala = 50 μm. (G) Micrografia confocal de resolução de célula única de E. coli fluorescente dentro da matriz de hidrogel. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Expansão da área em função do tempo das colônias de V. cholerae impressas em 1 mL de matrizes de suporte de hidrogel granular. Os dados do gráfico são provenientes da análise das imagens da Figura 8. Observou-se que as células móveis (círculo vermelho fechado e quadrado) se espalharam mais rapidamente do que as células não móveis, refletindo a disseminação tanto pelo crescimento quanto pela motilidade. Além disso, as células móveis na matriz de hidrogel com um grande tamanho de poro (quadrados vermelhos) espalharam-se a uma taxa mais rápida do que as células na matriz de hidrogel com poros de 0,3 μm (círculos vermelhos). As células não móveis não mostram diferença na taxa de expansão areal entre os dois tamanhos de poros, pois estão apenas crescendo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Colônias de V. cholerae impressas em 1 mL de matrizes de suporte de hidrogel granular. (A) Instantâneos do crescimento e motilidade de V. cholerae móvel em matriz hidrogel granular a 0,9% onde o tamanho dos poros é maior que o diâmetro celular médio. As setas indicam uma pluma difusa que se forma devido ao movimento das células através da matriz de hidrogel. (B) Instantâneos do crescimento e motilidade de V. cholerae móvel em uma matriz de hidrogel granular de 1,2% onde o tamanho dos poros é menor do que o diâmetro celular médio. As setas indicam uma pluma áspera, semelhante a fractal, que se forma devido ao crescimento celular. (C) Instantâneos da evolução temporal de V. cholerae não móvel em matriz de hidrogel granular a 0,9% onde o tamanho dos poros é maior que o diâmetro celular médio. Neste caso, plumas difusas que refletem a motilidade não são observáveis. (D) Instantâneos do crescimento de V. cholerae não móvel em uma matriz de suporte de hidrogel granular de 1,2% onde o tamanho dos poros é menor do que o diâmetro celular médio. Neste caso, plumas ásperas, semelhantes a fractais, refletindo o crescimento, são novamente observáveis. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Expansão da área em função do tempo das colônias de V. cholerae impressas em 20 mL de matrizes de suporte de hidrogel granular a 1,2%. Observa-se que células não móveis (círculos abertos) e móveis (círculos fechados) se espalham em taxas semelhantes nas primeiras 100 h. Após 100 h, diferenças nas taxas de expansão areal são observadas, potencialmente devido à evolução da variabilidade em tempos longos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Colônias de V. cholerae impressas em 22 mL de matrizes de hidrogel granular a 1,2% cultivadas a 37 °C. (Topo) Instantâneos do crescimento de V. cholerae móvel. (Parte inferior) Instantâneos do crescimento de V. cholerae não móvel. Em ambos os casos, plumas ásperas e semelhantes a fractais que refletem o crescimento são observáveis. Barras de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Caracterização das propriedades reológicas da matriz de hidrogel granular a 1,2% antes (0 h) e após o experimento (397 h). (A) Tensão de cisalhamento em função da taxa de cisalhamento aplicada. (B) Módulos de armazenamento e perda, G' e G'', respectivamente, em função da frequência de oscilação aplicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Comandos Gcode | Tarefas | |||
M82 | Modo de extrusão absoluta | |||
M302 S0 | Permitir extrusão a frio | |||
M92 E14575 | Ajuste as etapas de extrusão por mm | |||
G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 | Defina o eixo z e a posição de extrusão para zero, e a posição x-,y- para 35,71 mm e y 88 mm onde a cabeça de impressão está quando o código g é iniciado | |||
M221 S100 T0 | Define a taxa de fluxo para 100% | |||
M107 | Desligue o ventilador | |||
G1 F1 X35,61 Y81 E0,1 | Extrudir os 20 μL de biotinta para a matriz à taxa de alimentação de 50 μL/min, onde a posição atual foi definida | |||
G0 F200 Z60 | Puxe a agulha para fora da matriz e do contianer da amostra a uma velocidade de 200 mm/min | |||
G0 F500 X65.81 Y81.0 | Mover a agulha para o próximo contiainer de amostra a uma velocidade de 500 mm/min | |||
G0 F100 Z0 | Abaixe a agulha no próximo contiainer da amostra até a mesma posição z em que a impressão começou a uma velocidade de 100 mm/min | |||
G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 | Extrudir os 20 μL de biotinta para a matriz à taxa de alimentação de 50 μL/min, onde a posição atual foi definida | |||
G0 F200 Z60 | Puxe a agulha para fora da matriz e do contianer da amostra a uma velocidade de 200 mm/min | |||
G0 F500 X96.01 Y81.0 | Mover a agulha para o próximo contiainer de amostra a uma velocidade de 500 mm/min | |||
G0 F100 Z0 | Abaixe a agulha no contiainer da amostra até a mesma posição z em que a impressão começou a uma velocidade de 100 mm/min | |||
G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 | Extrudir os 20 μL de biotinta para a matriz à taxa de alimentação de 50 μL/min, onde a posição atual foi definida | |||
G0 F200 Z60 | Puxe a agulha para fora da matriz e do contianer da amostra a uma velocidade de 200 mm/min | |||
G0 F500 X126.21 Y81.0 | Mover a agulha para o próximo contiainer de amostra a uma velocidade de 500 mm/min | |||
G0 F100 Z0 | Abaixe a agulha no próximo contiainer da amostra até a mesma posição z em que a impressão começou a uma velocidade de 100 mm/min | |||
G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 | Extrudir os 20 μL de biotinta para a matriz à taxa de alimentação de 50 μL/min, onde a posição atual foi definida | |||
G0 F200 Z80 | Puxe a agulha para fora da matriz e do contianer da amostra a uma velocidade de 200 mm/min |
Tabela 1: Programação em código G para impressão de linhas verticais da suspensão bacteriana.
Arquivo suplementar 1: Arquivo STL para a braçadeira inferior Seringas Luer lock descartáveis de 1 mL para a extrusora de seringa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: Arquivo STL para a braçadeira superior para seringas Luer lock descartáveis de 1 mL para a extrusora de seringa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 3: Arquivo STL para o adaptador de seringa para seringas Luer lock descartáveis de 1 mL para a extrusora de seringa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 4: arquivo STL para o porta-amostras de cubeta. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 5: arquivo STL para o porta-amostra do frasco de tecido. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 6: Arquivo STL para a placa de 6 poços e a cama de impressão de placa de Petri de 35 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 7: Script personalizado para rastreamento de partículas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Etapas críticas do protocolo
É importante garantir que, ao preparar cada matriz de hidrogel, a matriz seja feita em um ambiente estéril. Caso contrário, pode ocorrer contaminação, que se manifesta como, por exemplo, microcolônias (pequenos esferoides) na matriz após vários dias. Durante o processo de mistura, é importante que todas as partículas de hidrogel granular seco sejam dissolvidas. Além disso, ao ajustar o pH de cada matriz de hidrogel com o NaOH, os grânulos começarão a inchar, o que aumenta a viscosidade da matriz de hidrogel, tornando a mistura mais difícil. O uso do misturador de suporte ajudará a garantir que o NaOH seja bem misturado à matriz de hidrogel. Durante o carregamento de cada suspensão bacteriana, bolsas de ar podem se formar na agulha. Para evitar esse problema, certifique-se de que a ponta da agulha esteja sempre sentada na suspensão bacteriana no tubo da centrífuga e não na parte inferior do tubo ou perto da superfície superior. Outra forma de superar essa questão é cultivar grandes volumes de células e, assim, ter volumes maiores da suspensão bacteriana para impressão.
Limitações
Atualmente, durante a impressão, a baixa viscosidade da suspensão bacteriana limita as geometrias que podem ser impressas e muitas vezes leva à formação de biofilme e crescimento no topo da superfície da matriz de hidrogel devido a células-traço. Existem alguns métodos potenciais para superar essa limitação, incluindo aumentar a viscosidade da suspensão bacteriana ou otimizar ainda mais as configurações da impressora 3D. Para aumentar a viscosidade da suspensão bacteriana, pode-se misturar a suspensão bacteriana com outro polímero - por exemplo, o alginato, que já foi usado anteriormente para a impressão 3D de bactérias em superfícies planas38. As configurações da impressora podem ser otimizadas para permitir a retração do êmbolo da seringa durante a retirada da agulha da matriz granular de hidrogel, o que teria o potencial de impedir que as células fossem depositadas durante a remoção da agulha da matriz de hidrogel.
A importância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
O método aqui descrito permite a impressão de colônias bacterianas em matrizes granulares de hidrogel. As matrizes granulares de hidrogel permitem o estudo do impacto de fatores ambientais externos (por exemplo, tamanho dos poros, deformabilidade da matriz) sobre a motilidade e o crescimento de bactérias. Além disso, enquanto neste trabalho, LB é usado como meio de crescimento líquido para inchar a matriz de hidrogel, a matriz de hidrogel pode ser inchada com outros meios de crescimento líquidos, incluindo meios com antibióticos. Métodos prévios para o estudo de bactérias em ambientes confinados eram limitados pelo tempo de experimentação, pelo tamanho da malha polimérica e pela rigidez da matriz de hidrogel circundante37,38. Já existem protocolos para a confecção de matrizes granulares de hidrogel a partir de diferentes polímeros, de modo que o potencial para estudar os impactos de diferentes condições ambientais sobre a motilidade e o crescimento de bactérias é vasto. Este método permite o estudo de bactérias em ambientes de controle que mais facilmente recapitulam os ambientes que as bactérias habitam no mundo real, como o muco do hospedeiro ou o solo. Outra limitação de muitos outros métodos é a opacidade da matriz circundante; no entanto, essa abordagem usando materiais opticamente transparentes fornece a capacidade de explorar, por exemplo, o controle optogenético e o padrão de bactérias em 3D.
Além de estudar a motilidade e o crescimento, o método de impressão 3D descrito aqui supera a limitação de muitos outros métodos de bioimpressão que exigem a deposição de uma biotinta em um substrato e, portanto, são limitados na altura do material vivo projetado que podem produzir. No futuro, este protocolo de bioimpressão pode ser expandido para fabricar materiais biohíbridos misturando polímeros com células formadoras de biofilme. As matrizes de hidrogel granulares fornecem suporte para impressão 3D de materiais vivos mais espessos e em maior escala e geometrias mais complexas do que muitos outros métodos atuais de bioimpressão de bactérias. Enquanto este trabalho utilizou apenas V. cholerae e E. coli, outras espécies, como Pseudomonas aeruginosa, também foram impressas com sucessoem 3D 37. Além da impressão, a impressora pode ser adaptada para fazer uma amostragem controlada de bactérias após o crescimento para ver se houve alguma alteração genética, por exemplo.
A plataforma experimental usada para imprimir e fotografar comunidades bacterianas em 3D nesta publicação é objeto de um pedido de patente depositado pela Universidade de Princeton em nome de Tapomoy Bhattacharjee e S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).
R.K.B. agradece o apoio do Programa de Bolsistas Presidenciais de Pós-Doutorado. Este material também é baseado em trabalho apoiado pela NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (para A.M.H.). A.S.D.-M. e H.N.L. agradecem o apoio do Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund da Universidade de Princeton. Agradecemos também ao laboratório de Bonnie Bassler pelo fornecimento de cepas de V. cholerae. A S.S.D. reconhece o apoio da NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 e EF-2124863, bem como do Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, da New Jersey Health Foundation, do Pew Biomedical Scholars Program e do Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 | |
15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope | |
Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
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