A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד
In This Article
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.
Abstract
יצירת סמנים ביולוגיים סינתטיים לפיתוח אבחון מדויק אפשרה זיהוי מחלות דרך מסלולים מעבר לאלה המשמשים למדידות ביו-נוזליות מסורתיות. סמנים ביולוגיים סינתטיים בדרך כלל עושים שימוש בכתבים המספקים אותות קריאים בנוזל הביולוגי כדי לשקף את השינויים הביוכימיים במיקרו-סביבה המקומית של המחלה במהלך היארעות המחלה והתקדמותה. הריכוז הפרמקוקינטי של המדווחים וההגברה הביוכימית של אות המחלה הם בעלי חשיבות עליונה להשגת רגישות גבוהה וספציפיות בבדיקת אבחון. כאן, פלטפורמה לאבחון סרטן בנויה באמצעות פורמט אחד של סמנים ביולוגיים סינתטיים: ננו-חיישנים מבוססי פעילות הנושאים כתבי DNA מיוצבים כימית שניתן לשחרר על ידי חתימות פרוטאוליטיות חריגות במיקרו-סביבה של הגידול. דנ"א סינתטי כמדווח מחלות מעניק יכולת ריבוב באמצעות השימוש בו כברקוד, המאפשר קריאה של חתימות פרוטאוליטיות מרובות בבת אחת. כתבי דנ"א המשוחררים לשתן מזוהים באמצעות נוקלאזות CRISPR באמצעות הכלאה עם RNA קריספר, אשר בתורו מייצרים אות פלואורסצנטי או קולורימטרי בעת הפעלת האנזים. בפרוטוקול זה נבנים ננו-חיישנים מבוססי פעילות המבוססים על ברקוד DNA ויישומם מודגם במודל עכברי פרה-קליני של סרטן מעי גס גרורתי. מערכת זו ניתנת לשינוי רב על פי הביולוגיה של המחלה ומייצרת אותות מחלה מרובים בו זמנית, מה שמאפשר הבנה מקיפה של מאפייני המחלה בתהליך זעיר פולשני הדורש מתן ננו-חיישנים בלבד, איסוף שתן ובדיקת נייר המאפשרת אבחון נקודתי.
Introduction
למרות המאמץ המשמעותי לזהות סמנים ביולוגיים של גידולים כגון חלבונים שנשפכו ודנ"א, תחום אבחון הסרטן היה מתוח על ידי השפע הנמוך שלהם או השפלה מהירה במחזור הדם1. כאסטרטגיה משלימה, סמנים ביולוגיים סינתטיים מהונדסים ביולוגית המגיבים באופן סלקטיבי לתכונות מחלה כדי ליצור אותות מוגברים מייצגים דרכים חדשות לקראת אבחון מדויק ונגיש 2,3. כדי לסייע בזיהוי, סמנים ביולוגיים סינתטיים אלה רותמים מנגנוני הפעלה תלויי גידול, כגון הגברה אנזימטית, כדי לייצר אנליטים עם יחס אות לרעש משופר4. כאן, קבוצה של אנזימים הקשורים לסרטן, פרוטאזות, ממונפים כדי להפעיל חיישנים ננומטריים הניתנים להזרקה....
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד המחברים. מתקנים סטנדרטיים לטיפול בבעלי חיים, כולל תאי דיור, ברדסים סטריליים, הרדמה והמתת חסד אתית נדרשים כדי לבצע ניסויים אלה כראוי. כל הניסויים נערכים בהתאם להנחיות מוסדיות וארציות ובפיקוח הצוות הווט?.......
Representative Results
מינוי מצעי פפטיד המופעלים על ידי פרוטאז
כדי לתכנן חיישנים שישקפו שינויים בפעילות הפרוטאוליטית של הרקמה, פעילות הפרוטאז ברקמה מאופיינת תחילה באמצעות ספרייה של גשושיות פפטידיות13 (איור 1). דגימות רקמה טריות וקפואות יכולות לספק מידע משמעותי על הפעילות.......
Discussion
כאן מוצגת פלטפורמה הניתנת להתאמה אישית רבה לגילוי סרטן מרובה משתתפים עם בדיקת שתן ניידת המעריכה פעילות פרוטאוליטית הקשורה למחלה באמצעות חיישן מוזרק זעיר פולשני. כאשר מופעל על ידי פרוטאזות גידוליות, מחשוף המצע הפפטידי מוגבר באמצעות שחרור ברקוד DNA לתוך השתן. את כתבי הדנ"א הסינתטי בדגי?.......
Disclosures
S.N.B., L.H. ו-R.T.Z. רשומים כממציאים בבקשת פטנט הקשורה לתוכן עבודה זו. S.N.B. מחזיקה במניות Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, והיא דירקטורית ב-Vertex; מייעץ למודרנה, ומקבל מימון מחקר ממומן מג'ונסון אנד ג'ונסון, רוויטופ וינשוף.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה של מכון קוך מספר P30-CA14051 מהמכון הלאומי לסרטן (מרכז סוונסון לביוטכנולוגיה), מענק מרכז ליבה P30-ES002109 מהמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, מרכז מרבל לננו-רפואה של סרטן במכון קוך, תוכנית מחקר הגבולות של מכון קוך באמצעות קרן קתי וקורט מארבל לחקר הסרטן, וקרן וירג'יניה וד.ק. לודוויג לחקר הסרטן. A.E.V.H. נתמך על ידי מלגת הכשרה קדם-דוקטורנטית במימון NIH (T32GM130546). S.N.B. הוא חוקר במכון הרפואי הווארד יוז. L.H. נתמכת על ידי K99/R00 Pathway to Independence Award מהמכון הלאומי לסרטן ומימון סטארט-אפ מאוניברסיטת בוסטון.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved