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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Abstract

A criação de biomarcadores sintéticos para o desenvolvimento de diagnósticos de precisão permitiu a detecção de doenças por vias além daquelas usadas para medições tradicionais de biofluidos. Os biomarcadores sintéticos geralmente fazem uso de repórteres que fornecem sinais legíveis no biofluido para refletir as alterações bioquímicas no microambiente local da doença durante a incidência e progressão da doença. A concentração farmacocinética dos repórteres e a amplificação bioquímica do sinal da doença são primordiais para alcançar alta sensibilidade e especificidade em um teste diagnóstico. Aqui, uma plataforma de diagnóstico de câncer é construída usando um formato de biomarcadores sintéticos: nanossensores baseados em atividade carregando repórteres de DNA quimicamente estabilizados que podem ser liberados por assinaturas proteolíticas aberrantes no microambiente tumoral. O DNA sintético como um repórter de doenças oferece capacidade de multiplexação por meio de seu uso como código de barras, permitindo a leitura de várias assinaturas proteolíticas de uma só vez. Os repórteres de DNA liberados na urina são detectados usando nucleases CRISPR via hibridização com RNAs CRISPR, que por sua vez produzem um sinal fluorescente ou colorimétrico após a ativação enzimática. Neste protocolo, nanosensores baseados em atividade e com código de barras de DNA são construídos e sua aplicação é exemplificada em um modelo pré-clínico de câncer colorretal metastático em camundongos. Esse sistema é altamente modificável de acordo com a biologia da doença e gera múltiplos sinais da doença simultaneamente, proporcionando uma compreensão abrangente das características da doença por meio de um processo minimamente invasivo que requer apenas administração de nanosensores, coleta de urina e um teste em papel que permite diagnósticos no ponto de atendimento.

Introduction

Apesar do esforço significativo para identificar biomarcadores tumorais, como proteínas excretadas e DNA, o campo diagnóstico do câncer tem sido tenso por sua baixa abundância ou rápida degradação na circulação1. Como estratégia complementar, biomarcadores sintéticos bioprojetados que respondem seletivamente às características da doença para gerar sinais amplificados representam novos caminhos para diagnósticos precisos e acessíveis 2,3. Para auxiliar na detecção, esses biomarcadores sintéticos aproveitam mecanismos de ativação dependentes do tumor, como a amplificação enzimática, para ....

Protocol

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da instituição dos autores. Instalações padrão de cuidados com animais, incluindo câmaras de alojamento, capuzes estéreis, anestesia e eutanásia ética são necessárias para realizar adequadamente esses experimentos. Todos os experimentos são conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais e supervisionados pela equipe veterinária da instituição. Camundongos BALB/c fêmeas, usados para.......

Representative Results

Nomeação de substratos peptídicos ativados por protease
Para projetar sensores que reflitam mudanças na atividade proteolítica do tecido, primeiramente caracteriza-se a atividade de proteases no tecido por meio de uma biblioteca de sondas peptídicas13 (Figura 1). Amostras de tecido fresco e congelado podem fornecer informações substanciais sobre a atividade proteolítica do microambiente tumoral combinando amostras de tecido com sondas FRET.......

Discussion

Apresentamos aqui uma plataforma altamente personalizável para detecção de câncer multiplexado com um teste de urina portátil que avalia a atividade proteolítica associada à doença usando um sensor injetado minimamente invasivo. Quando ativada por proteases tumorais, a clivagem do substrato peptídico é amplificada via liberação de código de barras de DNA na urina. Os repórteres de DNA sintético em uma amostra de urina podem ser lidos por uma amplificação enzimática secundária mediada por CRISP.......

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado em parte por uma concessão de apoio do Instituto Koch número P30-CA14051 do Instituto Nacional do Câncer (Swanson Biotechnology Center), um Core Center Grant P30-ES002109 do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, o Centro de Mármore do Instituto Koch para Nanomedicina do Câncer, o Programa de Pesquisa de Fronteira do Instituto Koch através do Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, e o Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A A.E.V.H. é apoiada por uma bolsa de treinamento pré-doutoral (T32GM130546) financiada pelo NIH. S.N.B. é investigador do Howard Hughes Medical Institute. L.H. é apoiado por um K99/R00 Pathway ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x NEB Buffer 2.1New England BiolabsB6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO groupIDTCustom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column AgilentHPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)GE HealthcareFPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)EMD milliporeVarious volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteineCPC ScientificCustom peptide
crRNAs IDTSee Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopyJEM-2100FJEOLcyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugatesCPC ScientificCustom peptide
Dynamic light scattering (DLS)DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µMNew England BiolabsM0653T
Experimental animalsTaconic BiosciencesBALB/cAnNTac6–8 weeks of age
gentleMACS C tubesMiltenyi Biotec130-093-237tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay KitMiltenyi BiotecMGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry BrukerMicroflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell lineKenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive groupJenKemA10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA ReagentInvitrogenO11492ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substratesIDTCustom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL columnGE HealthcareGE28-9909-44For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate readerTecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225

References

  1. Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
  2. Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M.

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