Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

Summary

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Abstract

A criação de biomarcadores sintéticos para o desenvolvimento de diagnósticos de precisão permitiu a detecção de doenças por vias além daquelas usadas para medições tradicionais de biofluidos. Os biomarcadores sintéticos geralmente fazem uso de repórteres que fornecem sinais legíveis no biofluido para refletir as alterações bioquímicas no microambiente local da doença durante a incidência e progressão da doença. A concentração farmacocinética dos repórteres e a amplificação bioquímica do sinal da doença são primordiais para alcançar alta sensibilidade e especificidade em um teste diagnóstico. Aqui, uma plataforma de diagnóstico de câncer é construída usando um formato de biomarcadores sintéticos: nanossensores baseados em atividade carregando repórteres de DNA quimicamente estabilizados que podem ser liberados por assinaturas proteolíticas aberrantes no microambiente tumoral. O DNA sintético como um repórter de doenças oferece capacidade de multiplexação por meio de seu uso como código de barras, permitindo a leitura de várias assinaturas proteolíticas de uma só vez. Os repórteres de DNA liberados na urina são detectados usando nucleases CRISPR via hibridização com RNAs CRISPR, que por sua vez produzem um sinal fluorescente ou colorimétrico após a ativação enzimática. Neste protocolo, nanosensores baseados em atividade e com código de barras de DNA são construídos e sua aplicação é exemplificada em um modelo pré-clínico de câncer colorretal metastático em camundongos. Esse sistema é altamente modificável de acordo com a biologia da doença e gera múltiplos sinais da doença simultaneamente, proporcionando uma compreensão abrangente das características da doença por meio de um processo minimamente invasivo que requer apenas administração de nanosensores, coleta de urina e um teste em papel que permite diagnósticos no ponto de atendimento.

Introduction

Apesar do esforço significativo para identificar biomarcadores tumorais, como proteínas excretadas e DNA, o campo diagnóstico do câncer tem sido tenso por sua baixa abundância ou rápida degradação na circulação¹. Como estratégia complementar, biomarcadores sintéticos bioprojetados que respondem seletivamente às características da doença para gerar sinais amplificados representam novos caminhos para diagnósticos precisos e acessíveis ^2,3. Para auxiliar na detecção, esses biomarcadores sintéticos aproveitam mecanismos de ativação dependentes do tumor, como a amplificação enzimática, para ....

Protocol

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da instituição dos autores. Instalações padrão de cuidados com animais, incluindo câmaras de alojamento, capuzes estéreis, anestesia e eutanásia ética são necessárias para realizar adequadamente esses experimentos. Todos os experimentos são conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais e supervisionados pela equipe veterinária da instituição. Camundongos BALB/c fêmeas, usados para.......

Discussion

Apresentamos aqui uma plataforma altamente personalizável para detecção de câncer multiplexado com um teste de urina portátil que avalia a atividade proteolítica associada à doença usando um sensor injetado minimamente invasivo. Quando ativada por proteases tumorais, a clivagem do substrato peptídico é amplificada via liberação de código de barras de DNA na urina. Os repórteres de DNA sintético em uma amostra de urina podem ser lidos por uma amplificação enzimática secundária mediada por CRISP.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225