Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

Abstract

ריצוף חד-תאי איפשר מיפוי של אוכלוסיות תאים הטרוגניות בסטרומה של איברים המטופויטיים. מתודולוגיות אלה מספקות עדשה שדרכה ניתן לחקור הטרוגניות שלא נפתרה בעבר במצב יציב, כמו גם שינויים בייצוג סוג התא הנגרמים על ידי לחצים חיצוניים או במהלך ההזדקנות. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים הדרגתיים לבידוד אוכלוסיות תאי סטרומה באיכות גבוהה מבלוטת התימוס האנושית והמורין, כמו גם עצם מורין ומח עצם. תאים המבודדים באמצעות פרוטוקולים אלה מתאימים ליצירת מערכי נתונים מולטיומיים באיכות גבוהה של תא יחיד. ההשפעות של עיכול דגימות, דלדול שושלת המטופויטית, ניתוח/מיון FACS וכיצד גורמים אלה משפיעים על תאימות עם ריצוף תא בודד נדונים כאן. עם דוגמאות של פרופילי FACS המצביעים על דיסוציאציה מוצלחת ולא יעילה ותפוקות תאי סטרומה במורד הזרם בניתוח שלאחר ריצוף, ניתנים מצביעים מזוהים למשתמשים. התחשבות בדרישות הספציפיות של תאי סטרומה היא קריטית להשגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור שיכולות לקדם את הידע בתחום.

Introduction

אצל מבוגר בריא, ייצור דה נובו של תאי דם מתרחש במח העצם ובבלוטת התימוס. תאי סטרומה באתרים אלה חיוניים לתחזוקת המטופויזה, אך סטרומה מהווה פחות מ-1% מהרקמה 1,2,3,4. השגת מבודדים טהורים של המטופויזה התומכת בסטרומה מהווה אפוא אתגר משמעותי, במיוחד עבור מולטיומיקה של תא בודד הדורשת עיבוד מהיר כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה. רכיבים של קוקטיילים שונים לעיכול עלולים להפריע לשלבים מסוימים בניתוח מולטיומיקס 5,6. הפרוטוקולים המוצגים כאן מפרטים את בידודם של מגוון רחב של תאי סטרומה ממח עצם ומרקמות תי....

Protocol

כל העבודה עם רקמות אנושיות בוצעה לאחר אישור על ידי מועצת הביקורת הפנימית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IRB). כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IACUC). C57Bl/6 עכברים, בני 8-10 שבועות, וזכרים ונקבות כאחד, שימשו במחקר הנו.......

Representative Results

פרוטוקולים אלה מניבים זני תאי סטרומה הניתנים לשחזור מהתימוס וממח העצם המתאימים לאנליזה ציטומטרית של זרימה, כמו גם מולטיומיקה של תא יחיד, כגון ריצוף scRNA. רקמת מורין תימית עוברת שיפוץ משמעותי בתגובה לגורמי סטרס, כגון ההתניה הציטוטוקסית שקודמת להשתלת מח עצם או תהליך ההזדקנות הטבעי. כתוצאה מכ.......

Discussion

תאי סטרומה באיברים המטופויטיים הם קריטיים לייצור דם תקין והפרעות סטרומה המטופויטיות עלולות לגרום לליקויים חמורים בתחזוקה ההמטופויטית ובתגובה ללחץ 9,23,24. תובנה של תאי סטרומה hematopoietic חיונית להבנת מחלות המטולוגיות 7,9,10,24 .......

Disclosures

D.T.S. היא דירקטורית ובעלת מניות ב-Agios Therapeutics וב-Editas Medicines; מייסד, דירקטור, בעל מניות וחבר מועצה מדעית מייעצת עבור Magenta Therapeutics ו- LifeVault Bio, בעל מניות ומייסד של Fate Therapeutics ו- Garuda Therapeutics, ודירקטור, מייסד ובעל מניות ב- Clear Creek Bio, יועץ ל- FOG Pharma, Inzen Therapeutics ו- VCanBio, ומקבל מימון מחקר ממומן מ- Sumitomo Dianippon. D.T.S ו-K.G הם ממציאי US20220143099A1 פטנטים.

Acknowledgements

נתמכנו בסיוע טכני מקצועי על ידי מתקן HSCI-CRM Flow Cytometry בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ומתקן Bauer Core באוניברסיטת הרווארד. T.K ו-K.G נתמכו על ידי מועצת המחקר השבדית ו-C.M. על ידי קרן המחקר הגרמנית. אנו מודים לסרגיי Isaev ול- I-Hsiu Lee על הסיוע בניתוח נתוני ריצוף RNA של תא יחיד.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

References

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induc....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved