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Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.
Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l'eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l'isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall'osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l'esaurimento del lignaggio ematopoietico, l'analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell'analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.
Nell'adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell'emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell'1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un'elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con ....
Tutto il lavoro con tessuti umani è stato condotto dopo l'approvazione del Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB). Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57Bl/6, di 8-10 settimane, sia maschi che femmine. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
Questi protocolli producono varietà di cellule stromali riproducibili dal timo e dal midollo osseo adatte per l'analisi citofluorimetrica, nonché per la multiomica a singola cellula, come il sequenziamento dello scRNA. Il tessuto timico murino subisce un significativo rimodellamento in risposta a fattori di stress, come il condizionamento citotossico che precede il trapianto di midollo osseo o il naturale processo di invecchiamento. Di conseguenza, la cellularità timica è drasticamente ridotta in entrambi questi cont.......
Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress 9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di svi.......
D.T.S. è direttore e azionista di Agios Therapeutics e Editas Medicines; fondatore, direttore, azionista e membro del comitato consultivo scientifico di Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, azionista e fondatore di Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics e direttore, fondatore e azionista di Clear Creek Bio, consulente di FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio e destinatario di finanziamenti per la ricerca sponsorizzati da Sumitomo Dianippon. D.T.S e K.G sono inventori di US20220143099A1 brevettuali.
Siamo stati supportati con l'assistenza tecnica di esperti dalla struttura di citometria a flusso HSCI-CRM del Massachusetts General Hospital e dalla struttura Bauer Core dell'Università di Harvard. T.K e K.G sono stati sostenuti dal Consiglio svedese per la ricerca e C.M. dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Ringraziamo Sergey Isaev e I-Hsiu Lee per l'assistenza nell'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
Medium 199 | Gibco | 12350 | |
Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
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