Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Summary

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Abstract

Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l'eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l'isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall'osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l'esaurimento del lignaggio ematopoietico, l'analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell'analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.

Introduction

Nell'adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell'emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell'1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un'elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con ....

Protocol

Tutto il lavoro con tessuti umani è stato condotto dopo l'approvazione del Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB). Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57Bl/6, di 8-10 settimane, sia maschi che femmine. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

Discussion

Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress ^9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di svi.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107