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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Abstract

Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l'eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l'isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall'osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l'esaurimento del lignaggio ematopoietico, l'analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell'analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.

Introduction

Nell'adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell'emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell'1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un'elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con ....

Protocol

Tutto il lavoro con tessuti umani è stato condotto dopo l'approvazione del Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB). Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57Bl/6, di 8-10 settimane, sia maschi che femmine. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

Representative Results

Questi protocolli producono varietà di cellule stromali riproducibili dal timo e dal midollo osseo adatte per l'analisi citofluorimetrica, nonché per la multiomica a singola cellula, come il sequenziamento dello scRNA. Il tessuto timico murino subisce un significativo rimodellamento in risposta a fattori di stress, come il condizionamento citotossico che precede il trapianto di midollo osseo o il naturale processo di invecchiamento. Di conseguenza, la cellularità timica è drasticamente ridotta in entrambi questi cont.......

Discussion

Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress 9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di svi.......

Acknowledgements

Siamo stati supportati con l'assistenza tecnica di esperti dalla struttura di citometria a flusso HSCI-CRM del Massachusetts General Hospital e dalla struttura Bauer Core dell'Università di Harvard. T.K e K.G sono stati sostenuti dal Consiglio svedese per la ricerca e C.M. dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Ringraziamo Sergey Isaev e I-Hsiu Lee per l'assistenza nell'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

References

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induc....

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Parole chiave Cellule stromaliOrgani ematopoieticiSequenziamento di singole celluleIsolamento cellulareTimoOssoMidollo osseoFACSMultiomicaDissociazione cellulare

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