* These authors contributed equally
כאן אנו מתארים פלטפורמה המאפשרת הדמיה לא פולשנית in vivo של ספרואידים בכבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר. תהליך העבודה משתרע מיצירת ספרואידים מתאי כבד ראשוניים להשתלה בעין העכבר והדמיית in vivo ברזולוציה תאית במיקרוסקופ קונפוקלי.
מחקרים ביו-רפואיים של הכבד ביונקים מעוכבים על ידי היעדר שיטות להדמיית אורך לא פולשנית in vivo ברזולוציה תאית. עד כה, הדמיה אופטית של הכבד באתרו אפשרית על ידי הדמיה תוך חיונית, המציעה הדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית אך לא ניתן לבצעה מספר פעמים ולכן אורכית באותה חיה. שיטות הדמיה לא פולשניות, כגון ביולומינסנציה, מאפשרות מפגשי הדמיה חוזרים על אותו בעל חיים אך אינן משיגות רזולוציה של תאים. כדי להתמודד עם פער מתודולוגי זה, פיתחנו פלטפורמה להדמיית in vivo לא פולשנית של ספרואידים בכבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר. בתהליך העבודה המתואר במחקר זה, כדורי כבד ראשוניים של עכברים נוצרים במבחנה ומושתלים בחדר הקדמי של העין של עכברים מושתלים, שם הם מושתלים בקשתית. הקרנית פועלת כחלון גוף טבעי דרכו אנו יכולים לדמיין את הספרואידים המושתלים במיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונלי. הספרואידים שורדים במשך חודשים בעין, שבמהלכם ניתן לחקור את התאים בהקשרים של בריאות וחולי, כמו גם להיות מנוטרים בתגובה לגירויים שונים על פני מפגשי הדמיה חוזרים ונשנים באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות מתאימות. בפרוטוקול זה, אנו מספקים פירוט של השלבים הדרושים ליישום מערכת הדמיה זו ומסבירים כיצד לרתום את הפוטנציאל שלה בצורה הטובה ביותר.
הניטור של תפקוד הכבד ביונקים במהלך בריאות ומחלות מוגבל על ידי היעדר טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה ולא פולשניות in vivo . ההדמיה של איבר זה מעוכבת על ידי מיקומו הבלתי נגיש, וכדי להרכיב תהליכים תאיים, מחקרי in vivo מסתמכים על הקרבת בעלי חיים בנקודות זמן שונות. כדי לעקוף מגבלת הדמיה זו, עבודה רבה מסתמכת על מודלים במבחנה , שבהם מיקרו-רקמות דמויות כבד מוצגות ונחקרות בסביבה מבוקרת.
בשנים האחרונות, פיתוח מערכות תרבית תלת ממדיות, כגון ספרואידים בכבד, סייע וקידם את חקר הכבד. ספרואידים בכבד הם אגרגטים רב-תאיים המחקים את המיקרו-סביבה ואת האינטראקציות המורכבות בין תאים של רקמת הכבד במידה מסוימת1 ומציעים יתרונות ברורים על פני תרביות חד-שכבתיות מסורתיות 2,3. ספרואידים בכבד משמשים גם כמודלים למחלות כבד שונות 4,5,6 וסייעו להבנת מנגנוני המחלה. עם זאת, מגבלות עיקריות של המודלים הנוכחיים של כבד במבחנה הן היעדר סביבה פיזיולוגית in vivo וזמן ניצול מוגבל בתרבית (סביב 20 יום)3. ספרואידים בכבד הושתלו בעבר באתרים שונים in vivo, כגון מתחת לכמוסת הכליה7 או intraperitoneally8, שאינם נגישים להדמיה אופטית. דימות כבד תוך חיוני היא טכניקה חדישה המציעה הדמיה ברזולוציית התא בזמן אמת. נכון לעכשיו, הדמיית כבד באתרו אפשרית רק על האיבר החיצוני, שהוא פולשני מאוד ולעתים קרובות טרמינל9. למרות שהתאמת חלון בטן תאפשר טיפולי הדמיה חוזרים ונשנים של הכבד, היא כרוכה בניתוח מורכב וטיפול לאחר מכן.
כדי לבצע ניטור אורכי ברזולוציה תאית, בחנו השתלה של ספרואידים בכבד לתוך החדר הקדמי של העין (ACE) של עכברים, שבו הרקמה דמוית הכבד מושתלת בסביבה פיזיולוגית, מחוברת לגירויי הגוף ונגישה לדימות אופטי. הקרנית היא רקמה שקופה ומשמשת כחלון דרכו ניתן לצלם מיקרו-רקמות המושתלות בקשתית באופן לא פולשני ואורכי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כאן, אנו מציגים זרימת עבודה של פלטפורמה חדשה זו שפותחה עבור הדמיה in vivo של ספרואידים בכבד10. פרוטוקול זה הוא מדריך שלב אחר שלב ליישומו, המחולק ל-(1) מיצוי תאי כבד ראשוניים של עכברים והיווצרות במבחנה של ספרואידים בכבד, (2) השתלת ספרואידים בכבד לתוך ACE של עכברים מושתלים, ו-(3) הדמיה in vivo של ספרואידים מושתלים בכבד בעכברים מורדמים. יתר על כן, נציג כמה מהאפשרויות והיישומים של פלטפורמת הדמיה זו.
כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במכון קרולינסקה.
1. מיצוי תאי כבד ראשוניים של עכבר ויצירת ספרואידים במבחנה
2. השתלת ספרואידים בכבד לחדר הקדמי של העין (ACE)
3. הדמיית In vivo של ספרואידים מושתלים בכבד ב- ACE
תאי כבד ראשוניים, מועשרים עבור הפטוציטים, בודדו מכבד העכבר על-ידי זילוח דו-שלבי של collagenase, תוך שימוש במשאבה פריסטלטית כדי להפיץ חוצצים חמים דרך הכבד, תוך ניצול כלי הדם של האיבר כדי להעביר אנזימי דיסוציאציה לכל התאים (איור 1A). לשם כך, הווריד הנבוב התחתון עבר קנולציה, והווריד הפורטלי נחתך כדי לאפשר זרימה של חוצצים (איור 1B). ראשית, חיץ מבוסס HBSS נשטף דרך הכבד כדי לנקות את הדם. אם הקנולציה מצליחה ואין קרישי דם, הכבד הופך לצהוב תוך מספר שניות. שנית, חיץ עיכול המכיל את תערובת האנזימים Liberase הופץ דרך הכבד כדי לנתק את הרקמה לתרחיף חד-תאי. התאים נספרו ידנית ונזרעו ללוחות ULA (96-well ultra-low-adherence), המאפשרים הרכבה עצמית לספרואידים תוך מספר ימים. ביום 5 נוצרים הספרואידים, והקפסולה הדקה הגובלת בכדוריות מעידה על צבירה מוצלחת (איור 1C). אנו מחכים ליום ה-10 להשתלה, ואז הספרואידים קומפקטיים ופיתחו קשרים חזקים בין תאים לתאים. מספר תאי הזרעים לבאר קבע את גודל הספרואיד של הכבד, כאשר 1000, 1200 ו-1500 תאים/באר הניבו ספרואידים של 238 מיקרומטר ± 10 מיקרומטר, 248 מיקרומטר ± 17 מיקרומטר ו-298 מיקרומטר ±-19 מיקרומטר (ממוצע ± SD), בהתאמה (איור 1C,D). להשתלה, אנו בוחרים ספרואידים בקוטר של כ -250 מיקרומטר מהסיבות הבאות: (1) גודל הספרואידים לא צריך להיות גדול מדי כדי למנוע היפוקסיה וליבה נמקית, אבל צריך להכיל מספיק תאים כדי לתמוך בתקשורת התא תאים ולאפשר עיצוב מחדש של השתל בעין, (2) המשקל של ספרואידים בגודל זה מאפשר להם להימשך לכיוון הקשתית ולשפר את קליטתם, (3) גודל זה מתאים ביחס להשתלת 5-10 ספרואידים לעין עכבר.
ניתוח ההשתלה דורש מזרק מושחל ידני המחובר לצינורית זכוכית (איור 2A). צינורית הזכוכית מורכבת מנימי זכוכית בורוסיליקט ששונו בתוך הבית כדי לקבל קצה קהה עדין באמצעות מושך מיקרופיפטה ומשופע. ניתן ליצור צינורית חלופית פשוטה יותר באמצעות צנתר פלסטיק מסחרי המחובר לצינור המזרק ומיוצב בקצה פיפטה (איור 2B). הניתוח כולל חיסון של ספרואידים בכבד לתוך ACE דרך חתך בקרנית (איור 2C). הספרואידים מוקמו על גבולות האישון כדי להפוך אותם לנגישים יותר להדמיה ולמנוע מהם לנוע לזווית העין. עכברי אלבינו שימשו להשתלה, מכיוון שהקשתית הלא פיגמנטית שלהם מאפשרת הדמיה in vivo של כדורי הכבד המושתלים. עכברים מושתלים הושתלו בשתי העיניים עם 7-10 ספרואידים לעין, ותמונות סטריאוסקופיות צולמו 3 ימים לאחר ההשתלה (פוסט-טקס) כמו גם שבוע וחודש לאחר Tx כדי לתעד את ריפוי הקרנית ואת הצלחת השתלת הספרואידים (איור 2D). יש לציין כי השינוי במראה של כדורי הכבד ב-ACE בין מועד ההשתלה הטרי לבין השתלתם המלא נובע מהתיישבות השתל על הקשתית, כמו גם מצמיחת חד-שכבה של תאי קשתית מעל הספרואידים. שיעור הצלחת ההשתלה של ספרואידים בכבד ב-ACE הוא 70% (n = 9 עיניים בעכברים זכרים ונקבות כאחד) (איור 2E). הימים הראשונים שלאחר Tx הם הקריטיים ביותר להישרדות ולקליטה, ככל הנראה בגלל שהחיה המושתלת משפשפת את עיניה ומשחררת את הספרואידים לפני שהקרנית החלימה. גודלם של כדורי הכבד אינו שונה באופן משמעותי לאחר Tx, ושינויים בצורה מיוחסים לעיצוב מחדש של השתל ולקליטתו (איור 2F). חודש לאחר Tx, כל הספרואידים המושתלים שהיו נוכחים בקשתית היו וסקולריים ועצבניים, כפי שניתן לראות על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית (איור 2G).
הדמיה לא פולשנית in vivo מבוצעת בעכברים מושתלים מורדמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף ומטרת טבילה למרחקים ארוכים (איור 3A, טבלה 2). הדמיה פלואורסצנטית ב-ACE יכולה להיות מושגת באמצעות גישות שונות, כפי שמתואר באיור 3B. הזרקת בדיקות פלואורסצנטיות למחזור הדם של העכבר המקבל מאפשרת הדמיה של סוגי תאים ומבנים שונים בתוך הספרואידים. השתמשנו בלקטין כדי לסמן כלי דם (איור 3C), ב-CMFDA כדי לצפות ברשת קנאליקולי המרה (איור 3D) וב-pHrodo-LDL, שאישר ספיגה פעילה של LDL בתאים ספרואידים (איור 3E). ניתן להשתמש גם בכדורי כבד שנוצרו ממודלים של עכברי כתב. אלבומין-Cre:tdTomato ספרואידים אפשרו תיוג ומעקב אחר הפטוציטים (איור 3F), וספרואידים המבטאים את הביו-חיישן פלואורסצנטי של מחוון מחזור תאי יוביקוויטין (FUCCI) שימשו כדי להמחיש דינמיקה של מחזור התא ברזולוציה של תא בודד (איור 3G). לבסוף, ספרואידים בכבד יכולים לעבור הנדסה גנטית במבחנה לפני ההשתלה, ובמקרה של התמרה של נגיף הקשור לאדנו (AAV)-GFP, הביטוי נצפה in vivo במשך יותר מ-6 חודשים (איור 3H).
איור 1: בידוד של הפטוציטים ראשוניים של עכברים ויצירת ספרואידים בכבד. (A) חומר וציוד המשמשים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים של עכברים: 1. מאגרי בידוד; 2. אמבט מים; 3. משאבה פריסטלטית; 4. צלחת פטרי; 5. מסננת תאים; 6. כרית סופגת; 7. מחצלת נתיחה; 8. מרים תאים; 9. מחט פרפר 27 גרם; 10. כלי נתיחה. (B) חלל הבטן במהלך הניתוח: הווריד קאווה מחורר ומחורר, והווריד הפורטלי נחתך כדי לאפשר זרימה של החוצצים. (C) תמונות ברייטפילד של היווצרות ספרואידים בכבד במבחנה ב-0 (d0), 5 (d5) ו-10 (d10) ימים לאחר הזריעה, פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D) גודל ספרואיד כבד בריכוזי זריעת תאים שונים, n = 21 ספרואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השתלה והשתלה של ספרואידים בכבד לתוך ACE של עכברים. (A) חומרים וציוד המשמשים להשתלה (Tx) של ספרואידים בכבד לתוך ACE: 1. ספרואידים של כבד בצלחת תרבית; 2. מלוחים סטריליים; 3. משחת עיניים; 4. מחטים 23 גרם; 5. קנולה; 6. מזרק המילטון; 7. צינור גז הרדמה; 8. מחזיק ראש ומסכת גז; 9. כרית חימום; 10. לוח בסיס מתכת בהתאמה אישית; 11. מלקחיים ומפרק אוניברסלי מוצק. (ב) התקנת מזרק קנולה והמילטון: 1. צינורית זכוכית המחוברת למזרק המילטון באמצעות צינורות פורטקס ומחט 27G; 2. צינורית זכוכית מחוברת לצינורות הפורטקס באמצעות מקטעים נוספים של צינורות סיליקון וצינורות PharMed; 3. צינורית פלסטיק חלופית שהורכבה; 4. חלקים המרכיבים את צינורית הפלסטיק: צנתר פלסטיק 24G BD Insyte המחובר באמצעות צינורות PharMed ועטוף בקצה פיפטה חתך של 10 μl ליציבות ואחיזה. (C) איור של שלבי ניתוח Tx: 1. הספרואידים נאספים לתוך הצינורית; 2. הקרנית מנוקבת במחט; 3. הצינורית מוחדרת לחתך, והספרואידים משתחררים לתוך ACE; 4. מבחוץ של העין, הספרואידים ממוקמים קרוב לאישון והרחק מהחתך. (D) תמונות סטריאוסקופיות של כדורי כבד (sph) בעין העכבר ביום הניתוח וב-3, 7 ו-30 יום לאחר הניתוח. חצים מצביעים על ספרואידים בני קיימא. (E) ספרואיד כבד (גודל של 1200 תאים/באר) קצב קליטה לאחר Tx, n = 9 עיניים ב-6 עכברים מושתלים. (F) גודל ספרואידים בכבד בתרבית, לפני ההשתלה (במבחנה, n = 20 ספרואידים מהכנה יחידה) וחודש לאחר Tx ב-ACE (in vivo, n = 16 ספרואידים ב-3 עכברים מושתלים), המחושב על ידי ממוצע קטרים אנכיים ואופקיים. (G) צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים מושתלים בכבד חודשיים לאחר Tx, המראה וסקולריזציה (CD31, ורוד, קו מקווקו תוחם את המסה הספרואידית) ועצבוב סימפתטי (טירוזין הידרוקסילאז (TH), כתום), סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הנתונים עבור לוח F הותאמו באישור Lazzeri-Barcelo et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה תוך-עינית לא פולשנית in vivo של ספרואידים מושתלים בכבד. (A) חומר וציוד המשמשים להדמיית ACE in vivo : 1. מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר זקוף; 2. קופסה כהה; 3. שלב XYZ ממונע; 4. טבילה-מטרה; 5. מחזיק ראש ומסכת גז; 6. מלקחיים ומפרק אוניברסלי מוצק; 7. כרית חימום; 8. פלטת בסיס מתכת בהתאמה אישית. (B) דיאגרמה המתארת גישות שונות המשמשות להדמיית in vivo של קריאות פלואורסצנטיות בכדורי כבד המושתלים בעין. (ג-ח) תמונות מייצגות של ספרואידים בכבד ACE במהלך הדמיה in vivo במיקרוסקופ קונפוקלי. אות הפיזור האחורי משמש לצפייה בנפח ובמבנה הספרואידים; (C) כלי דם המסומנים על ידי הזרקת לקטין פלואורסצנטי, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר; (D) רשת Bile canaliculi המסומנת על ידי הזרקה של CMFDA פלואורסצנטי, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר; (E) ספיגת LDL על ידי הזרקה של בדיקת pHrodo-LDL פלואורסצנטית, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר; (F) הפטוציטים המבטאים Td-Tomato, ראשי חץ מציינים גרעינים וכוכביות מציינות כלי דם תוך-ספרואידיים, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר; (G) ניטור הדינמיקה של מחזור התא בכדורי כבד המבטאים FUCCI, מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר (תמונה ראשית) ו-20 מיקרומטר (ניפוח). (H) ספרואידים בכבד שהותמרו במבחנה עם AAV8-GFP לפני Tx וצולמו בעין 6 חודשים לאחר Tx, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. התמונה בלוח G הותאמה באישור Lazzeri-Barcelo et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: פתרונות המשמשים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים של עכבר. הרכב פתרונות ומאגרים הדרושים לבידוד הפטוציטים של עכבר. יש לערבב את רכיבי חיץ העיכול ותמיסת שיפוע טריים ביום הבידוד. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2. הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP5 המשמש להדמיית תוך עינית in vivo של ספרואידים בכבד. הטבלה הותאמה באישור Lazzeri et al.10. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה חדשנית להדמיית in vivo תוך עינית של ספרואידים בכבד המושתלים ב- ACE. ה-ACE שימש בעבר כאתר השתלה של מיקרו-רקמות אחרות שמקורן באיברים, כגון איי לבלב11,12, בשל המיקרו-סביבה הייחודית שלו, היותו עשיר בכלי דם, עצבים וחמצן, והגישה לדימות דרך הקרנית. בעוד שהדמיית כבד תוך חיונית מאפשרת הדמיה של תאים ותהליכים באתרם, ניטור אורכי אינו אפשרי. הדמיית כבד דרך חלון בטן כרוכה בניתוח מורכב, ותנועת האיבר בתוך הגוף מקשה על מעקב של תא בודד לאורך זמן. לפיכך, שיטת הדמיה חדשנית זו מאפשרת ניטור אורכי לא פולשני של תאי כבד ברזולוציה של תא בודד.
פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים. הראשון הוא בידוד של הפטוציטים ראשוניים באמצעות זילוח collagenase דו-שלבי, המותאם מ- Charni-Natan et al.13, עם ההבדל שאנו מבצעים את זילוח הכבד על העכבר המת במקום על בעלי החיים החיים המורדמים. וריאציה זו מביאה יתרונות מסוימים, כגון פחות שיקולים אתיים והימנעות משאריות הרדמה באורגניזם. בעבודה זו, אנו מייצרים ספרואידים בכבד מהחלק המועשר בהפטוציטים של הבידוד, אך זה אינו שולל את הפוטנציאל לבודד אוכלוסיות תאים אחרות שאינן פרנכימליות באמצעות פרוטוקולים מיוחדים אחרים לייצור ספרואידים של תרבות משותפת בהרכב מגוון14,15.
החלק השני של פרוטוקול זה כולל השתלה של כדורי הכבד לתוך ACE של עכברים מושתלים. זהו ניתוח מהיר (מתחת ל-10 דקות) ופשוט המבוצע בעכברים מורדמים ואינו דורש כל טיפול לאחר הניתוח. הקרנית מנקבת את עצמה ומחלימה במשך 3-5 ימים. לעיתים, במהלך תהליך הריפוי, נצפה ערפול מסוים סביב החתך, אך זה חולף תוך מספר ימים. לא חווינו מקרים של סינכיה קדמית בעיני בעלי חיים מנותחים. אנו מבצעים את הליכי ההשתלה במעבדה נקייה אך באוויר הפתוח וללא בעיות של זיהומים בעיניים המנותחות. החיסון וקליטת הספרואידים בעין אינם פוגעים בראייה או משנים את התנהגותו של בעל החיים המקבל. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהרדמה איזופלורנית הן לניתוחי השתלה והן להדמיית in vivo , אשר נסבלת היטב בעכברים. בשל השפעתו התלויה במינון, ניתן להתאים אותו בקלות לאורך כל ההליכים ומביא את היתרון של הפחתת זמני שינה והתעוררות. עם זאת, ניתן להשתמש בחומרי הרדמה חלופיים בהזרקה. לאחר ההשתלה, אנו בדרך כלל מאפשרים חודש אחד עבור הספרואידים להיקלט באופן מלא, להיות כלי דם, ועצבני, לפני ביצוע התערבויות טיפוליות הדמיית in vivo . הראינו גם כי השתלה והשתלה אפשרית באמצעות ספרואידים של כבד אנושי ועכברים מושתלים מדוכאי חיסון10.
החלק השלישי של שיטה זו הוא הדמיה in vivo של ספרואידים כבד מושתלים ב ACE. פרוטוקול זה מתאר את מערך ההדמיה in vivo , המשתמש בציוד מיקרוסקופיה הנפוץ במתקני הדמיה מחקריים. יתר על כן, החומרים המיוחדים, כגון מחזיק ראש העכבר וצינורית הפלסטיק, זמינים כעת באופן מסחרי. בעזרת מערך הדמיה זה, אנו מסוגלים ללכוד חתכי z ולקבל שחזור תלת מימדי של ארכיטקטורת הספרואידים, בהתאם לעומק חדירת הלייזר וגילוי הפלואורסצנטי. ניטור תפקוד התאים בכדורי הכבד המושתלים מסתמך על הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים המדווחים על סוגי תאים, תפקודים תאיים ודינמיקה. לפיכך, פלטפורמת הדמיה זו יכולה להיות מנוצלת באמצעות שיטות שונות, לבד או בשילוב: (1) בדיקות פלואורסצנטיות יכולות להינתן תוך ורידי, למשל, נוגדנים כדי לסמן ולעקוב אחר תאים כמו גם צבעים פונקציונליים; (2) ספרואידים בכבד יכולים להיווצר מתאים שבודדו ממודלים של עכברי כתב המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לכבד, למשל, ספרואידים של כבד FUCCI המדווחים על דינמיקה של מחזור התא; (3) היווצרות ספרואידים בכבד במבחנה יכולה להיות משולבת עם טרנספקציה או טרנסדוקציה, כדי לצייד את הספרואידים בחלבונים פלואורסצנטיים ובביוסנסורים. למשל, וירוסים הקשורים לאדנו. בסביבות הניסוי שלנו ועל ידי שימוש בפוטון יחיד לעירור, עומק ההדמיה שניתן להשיג הוא בערך 60-100 מיקרומטר. עם זאת, הדבר תלוי בעוצמת הלייזר ובזמינות ההדמיה המולטיפוטית, במאפייני הפליטה של הבדיקה הפלואורסצנטית וברגישות הגלאים, כמו גם בזווית העין בה מושתל הספרואידים. לאחר רכישת ההדמיה, ניתוח התמונה במורד הזרם יכול להתבצע באמצעות תוכניות פופולריות כגון Image J ו- Imaris. לדוגמה, במקרה של כתב FUCCI, ניתן לספור תאים פעילים במחזור התא בירוק ולהנגיד אותם למספר הכולל של תאים אדומים כדי להעריך את פעילות מחזור התא בתוך הספרואיד המושתל. בנוסף, פלטפורמת ההדמיה ACE מאפשרת למרוח חומרים על העין (בצורה של טיפות עיניים) או להזריק ישירות לתוך ACE כדי לטפל בשתל ולנטר את התגובה שלו. לאחר המוות, הספרואידים המושתלים ניתנים לאחזור בקלות על ידי מיקרודיסקציה ידנית ויכולים לספק מידע רב ערך על ידי טכניקות ex vivo , כגון צביעה אימונופלואורסצנטית, ניתוח שעתוק וכו '.10.
טכניקה זו יש מגבלות מסוימות. הראשונה היא שמניסיוננו, העכברים המקבלים חייבים להיות לבקנים, כלומר בעלי קשתית ללא פיגמנטציה. עם ההשתלה, הספרואידים של הכבד מתכסים על ידי שכבה אחת של תאי קשתית, אשר אינה משפיעה על הכדאיות או התפקוד של הספרואידים, אך הפיגמנט בתאי הקשתית מונע הדמיה. שיקול שני הוא היציבות במהלך הדמיה תוך עינית בעכברים מורדמים. במהלך מפגשי ההדמיה in vivo , יש לעקוב מקרוב אחר ריכוז ההרדמה והנשימה של בעל החיים כדי למזער את התנועה. עם זאת, באמצעות הגדרות ההדמיה שצוינו כאן, אנו מסוגלים להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר יישום של פלטפורמת הדמיה לא פולשנית in vivo של רקמה דמוית כבד המושתלת בעיניהם של עכברים. אנו משתמשים בהליכים קלים, ציוד נפוץ וחומרים במחיר סביר, מה שהופך אותו לגישה בת השגה עבור חוקרים רבים. מודל זה משלב את היתרונות של ספרואידים תלת-ממדיים של כבד במבחנה עם הסביבה in vivo והנגישות האופטית המסופקת על ידי ACE כדי ליצור פלטפורמה רבת ערך לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של הכבד במחקר בסיסי ובמסגרות פרה-קליניות.
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה השבדית לסוכרת, קרנות מכון קרולינסקה, מועצת המחקר השבדית, קרן נובו נורדיסק, קרן משפחת ארלינג-פרסון, תוכנית מחקר אסטרטגית בסוכרת במכון קרולינסקה, קרן קנוט ואליס ולנברג, קרן Jonas & Christina af Jochnick, האגודה השבדית לסוכרת ו- ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. ציורי הדמויות נוצרו על ידי FL-B באמצעות BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved