הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

Abstract

מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקיד מפתח בוויסות חילוף החומרים התאי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ייצור ROS פיזיולוגי ממלא תפקיד מרכזי באפנון המרחבי והזמני של תפקודים תאיים נורמליים כגון התפשטות, איתות, אפופטוזיס והזדקנות. לעומת זאת, ייצור יתר כרוני של ROS אחראי למגוון רחב של מחלות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם וסוכרת, בין היתר. לכן, כימות רמות ROS באופן מדויק וניתן לשחזור חיוני להבנת הפונקציונליות התאית הרגילה. שיטות מבוססות הדמיה פלואורסצנטית לאפיון מיני ROS תוך-תאיים היא גישה נפוצה. רבים מפרוטוקולי ההדמיה ROS בספרות משתמשים בצבע 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). עם זאת, צבע זה סובל ממגבלות משמעותיות בשימוש וביכולת הפרשנות שלו. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בגשושית פלואורסצנטית דיהידרואתידיום (DHE) כשיטה חלופית לכימות הייצור הכולל של ROS בסביבה של תפוקה גבוהה. פלטפורמת ההדמיה בעלת התפוקה הגבוהה, CX7 Cellomics, שימשה למדידה וכימות של ייצור ROS. מחקר זה נערך בשלושה קווי תאים של סרטן הכבד - HepG2, JHH4 ו- HUH-7. פרוטוקול זה מספק תיאור מעמיק של ההליכים השונים המעורבים בהערכת ROS בתוך התאים, כולל - הכנת תמיסת DHE, דגירה של תאים עם תמיסת DHE, ומדידת עוצמת DHE הדרושה לאפיון ייצור ROS. פרוטוקול זה מדגים כי צבע פלואורסצנטי DHE הוא בחירה חזקה וניתנת לשחזור לאפיון ייצור ROS תוך תאי באופן בתפוקה גבוהה. גישות תפוקה גבוהה למדידת ייצור ROS עשויות להיות מועילות במגוון מחקרים, כגון טוקסיקולוגיה, סינון תרופות וביולוגיה של סרטן.

Introduction

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם קבוצה של רדיקלים כימיים טבעיים, תגובתיים מאוד ובלתי יציבים באופן זמני הנוצרים כחלק מחילוף החומרים התאי הרגיל בתאים. ROS ממלא תפקיד מפתח וחיוני באפנון תהליכים פיזיולוגיים וביוכימיים נורמליים המתרחשים בתאים ^1,2. המקור העיקרי לייצור ROS בתאים הוא ממסלול שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית (ETC) כחלק מהמחזור הביו-אנרגטי הרגיל. מקורות משמעותיים נוספים לייצור ROS כוללים תגובות אנזימטיות כגון NADPH אוקסידאזות תאיות בתאים. חילוף החומרים של מולקולות מזון (למשל, גלוקוז) מתרחש דרך מסלול הזרחן החמצוני במטריצה המיטוכונדריאלית. רמה בסיסית של ייצור ROS חיונית לוויסות תהליכי איתות פיזיולוגיים תקינ....

Protocol

1. תרבית תאים

1. זרעו את תאי הבדיקה (HepG2, HUH7 ותאי קרצינומה הפטוצלולרית JHH4) לצלחת בת 96 בארות בצפיפות זריעה של 10,000 תאים לבאר בנפח זריעה סופי של 200 מיקרוליטר לבאר.
   1. לפני תרבית תאי HepG2, צפו את 96 בארות הצלחת בקולגן מסוג IV (50 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע התמצקות ?.......

Discussion

במחקר זה, פרוטוקול להערכת ייצור מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) המונע על-ידי סופראוקסיד באמצעות צבע פלואורסצנטי דיהידרואתידיום (DHE) נקבע על מערכת סינון בעלת תוכן גבוה. רוב הפרוטוקולים הנוכחיים הזמינים בספרות משתמשים ב- DCFH-DA כבדיקת הדמיה פלואורסצנטית לכימות מיני ROS. עם זאת, מחקרים רבים הראו כי DC.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625