Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

Summary

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham um papel fundamental na regulação do metabolismo celular em processos fisiológicos e patológicos. A produção fisiológica de ERO desempenha um papel central na modulação espacial e temporal de funções celulares normais, como proliferação, sinalização, apoptose e senescência. Em contraste, a superprodução crônica de ERO é responsável por um amplo espectro de doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e diabetes, entre outras. Quantificar os níveis de ROS de forma precisa e reprodutível é, portanto, essencial para entender a funcionalidade celular normal. Métodos baseados em imagens de fluorescência para caracterizar espécies intracelulares de ROS é uma abordagem comum. Muitos dos protocolos de imagem ROS na literatura utilizam o corante diacetato de 2'-7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). No entanto, este corante sofre de limitações significativas em seu uso e interpretabilidade. O protocolo atual demonstra o uso de uma sonda fluorescente de diidroetídio (DHE) como um método alternativo para quantificar a produção total de ROS em um ambiente de alto rendimento. A plataforma de geração de imagens de alto rendimento, CX7 Cellomics, foi usada para medir e quantificar a produção de ROS. Este estudo foi realizado em três linhagens de células de câncer hepatocelular - HepG2, JHH4 e HUH-7. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos vários procedimentos envolvidos na avaliação de ROS dentro das células, incluindo - preparação de solução de DHE, incubação de células com solução de DHE e medição da intensidade de DHE necessária para caracterizar a produção de ROS. Este protocolo demonstra que o corante fluorescente DHE é uma escolha robusta e reprodutível para caracterizar a produção intracelular de ROS de forma de alto rendimento. Abordagens de alto rendimento para medir a produção de ROS provavelmente serão úteis em uma variedade de estudos, como toxicologia, rastreamento de drogas e biologia do câncer.

Introduction

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um grupo de radicais químicos de ocorrência natural, altamente reativos e temporalmente instáveis formados como parte do metabolismo celular normal nas células. As ERO desempenham um papel fundamental e essencial na modulação dos processos fisiológicos e bioquímicos normais que ocorrem nas células ^1,2. A principal fonte de produção de ERO nas células é a via da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) como parte do ciclo bioenergético normal. Fontes adicionais significativas de produção de ROS incluem reações enzimáticas como NADPH oxidases celulares em célula....

Protocol

1. Cultura celular

1. Semeando as células teste (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 e JHH4) em uma placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células/poço em um volume final de semeadura de 200 μL por poço.
   1. Antes de cultivar as células HepG2, revestir os 96 poços de placa com colágeno tipo IV (50 μg/mL) por 2 h de duração à temperatura ambiente (TR). Para evitar a solidificação do colágeno estoque, coloque a solução estoque em gelo e, posteriorme.......

Discussion

Neste estudo, um protocolo para avaliar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares impulsionadas por superóxido usando corante de fluorescência diidroetídio (DHE) foi estabelecido em um sistema de triagem de alto conteúdo. A maioria dos protocolos atuais disponíveis na literatura utiliza a DCFH-DA como sonda de imagem de fluorescência para quantificar espécies de ROS. No entanto, vários estudos têm demonstrado que a DCFH-AD não é uma sonda ideal para a mensuração de ERO intracelula.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625